细胞黏附分子Peroxinectin在中华绒螯蟹先天免疫应答中的作用机制研究

Based on the previous work， this project intends to study on the interaction relationship between Peroxinectin and beta integrin and CuZn-SOD in the Chinensis mitten crab, Eriocheir sinensis, using RACE, real-time fluorescence quantitative PCR and RNA interference methods,and further analysis the the change of the related genes expression,including the expression of the antibacterial gene and main enzymes genes of the phenol oxidase enzyme system and anti oxidase system, clarify the innate immune response mechanism of Peroxinectin in Chinese mitten crab;this research will provide a theoretical basis to find a scientific disease prevention and control measure,improve resistance to diseases, and achieve the sustainable development of the aquaculture industry; this study has a very important theoretical significance to in-depth understanding of the innate immune function and regulation mechanism in invertebrates and improving the crustacean immunology content.

本项目拟在申请人前期工作基础上，采用RACE、实时荧光定量PCR和RNA干扰等生物技术，进一步研究中华绒螯蟹细胞黏附分子Peroxinectin与β-整合素和CuZn-SOD之间的相互作用关系,同时分析由此作用引起的机体抗菌肽基因 (ALF、Crustin和Lectin）、抗氧化酶系统主要酶类基因（Mn-SOD、GPX、CAT和GST）和酚氧化酶酶系统主要酶类基因（PO、proPO和PPAF）表达变化规律，系统全面的阐明Peroxinectin在中华绒螯蟹先天免疫应答中的作用机制；为寻找更科学的蟹病防治措施、提高养殖对象抗病能力,实现养殖产业的可持续发展提供理论基础；本研究对深入了解无脊椎动物的先天性免疫功能与调节机制和完善发展甲壳动物免疫学内容都具有十分重要的理论意义。

中华绒螯蟹( Eriocheir sinensis ) 作为我国重要增养殖对象之一，关于其免疫机制的研究越来越受到人们的重视。细胞黏附分子作为一种影响细胞行为的重要信号蛋白，在中华绒螯蟹先天免疫反应中发挥重要作用，为了进一步研究细胞粘附蛋白发挥免疫作用的分子机理，本项目借助高通量测序技术对中华绒螯蟹血细胞转录组进行了分析，筛选获得了项目所需的与免疫相关基因序列； 在此基础上，通过细菌感染和结合、体内细菌清除等试验发现，嗜水气单胞菌感染显著影响 Peroxinectin mRNA 的表达，且 Peroxinectin 重组蛋白能以不同亲和 力与枯草芽孢杆菌、嗜水气单胞菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌等革兰氏阴性 菌和革兰氏阳性菌结合，同时促进机体对副溶血弧菌的清除能力，表明Peroxinectin 蛋白在中华绒螯蟹抗病过程中发挥重要作用；为了进一步研究 Peroxinectin 蛋白发挥作用的分子机制，本项目通过 GST-pulldown 和双分子荧光互补试验发现，Peroxinectin 通过与β-Integrin 和 CuZn-SOD 的相互作用引起机体的免疫应答反应，三者之间在原核和真核细胞中 均能发生相互作用，且在真核细胞细胞核中结合，siRNA 体内干Peroxinectin 表达 48h 也发现，与对照组相比，血细胞中的 Peroxinectin 表达量下降 50%左右， 同时免疫相关基因 Integrin、CuZn-SOD、GST、Dorsal、Lectin 的表达量出现显著性下降（P<0.05），说明抑制 Peroxinectin 表达显著影响了与其相互作用的 Integrin、CuZn-SOD 和信号传导相关基因及效应基因的表达，进一步阐明了 Peroxinectin 在中华绒螯蟹先天免疫应答作用的分子机制；为了更好的阐明中华绒螯蟹对外源环境胁迫因子的免疫应答反应，本项目还研究了重金属（Cu2+、Cd2+）、饲料中锰元素的添加量和养殖密度等环境胁迫因子对中华绒螯蟹免疫相关基因表达的影响，结果发现，重金属Cu2+、Cd2+胁迫且显著影响其中华绒螯蟹免疫相关基因的表达，且获得了中华绒螯蟹幼体饲料中 Mn 的添加量为 30.34 mg/kg，试验试验地区健康生态养殖密度为 1200 只/亩左右，为实际生产提供了科学数据和决策。