核衣壳抑制剂GLS4致乙型肝炎病毒核心抗原细胞内凝聚降解及其继发抗病毒作用机制研究

Hepatitis B virus (HBV) core proteins play key roles in the life cycle of cirus replication by comprising the viral capsid to protect and transprot the virus genome RNA and DNA. Moreover, core proteins have been shown to interact with histones and to bind the nuclear circular covalently closed DNA (cccDNA), therefore may contribute to the regulation of cccDNA function. HBV core protein or capsid are emerging as interesting targets for the development of new potent antiviral agents. Here we introduced GLS4, a novle HBV capsid inhibitor, was with potent antiviral activities to both wild type and nucleos(t)ide analogue-resistant HBV strains. Recently, we firstly found that GLS4 treatment in HBV replicating cells could cause aggregation of core protein while potently inhibiting the capsid formation, indicating the mechanism different from other agents. In this study, we will further investigate the formation and degradation of core preotein aggregates and their relationship with cell autophagy in both cell models and anmial models. Meanwhile, cascade effects of this capsid inhibitor, including HBV pregenomic RNA-triggered innate immune responses and cccDNA transcription inhibition will be determined as well. This study will give deep insight to the direct and indirect antiviral activities for HBV capsid inhibitors, providing more clues for anti-HBV drug development.

乙型肝炎病毒（HBV）核心抗原可装配为病毒核衣壳保护和运送病毒基因组，并可结合至HBV共价闭合环状DNA（cccDNA）维持其转录活性。以病毒核心抗原和核衣壳组装为靶点的核衣壳抑制剂日渐成为抗HBV新药研发热点。我们的前期工作表明，新型核衣壳抑制剂GLS4能够高效抑制HBV复制。近期，申请者首次发现GLS4高效阻断HBV细胞模型内病毒正常核心颗粒组装的同时，可导致胞内核心抗原颗粒状凝聚并加速其降解，这一独特现象区别于其他核衣壳抑制剂，且在长期作用过程中能够显著抑制胞内cccDNA池的转录能力。本研究将基于细胞模型和动物模型，一方面对胞内核心抗原不溶性聚集体的形成和可能诱发的细胞内自噬降解机制进行研究；一方面，对核心抗原降解后继发的抗病毒先天免疫应答和cccDNA转录活性调节作用进行研究，创新性多角度探讨核衣壳抑制剂的直接和继发抗病毒机制，为深入开展抗乙型肝炎病毒药物的研发提供重要支持依据。

异芳基二氢嘧啶类化合物GLS4 作为我国具有自主知识产权的抗乙型肝炎病毒（HBV）活性化合物，具有高抗病毒活性和低细胞毒性，具有良好的药物开发前景。申请者前期研究表明GLS4既能够干扰正常核心颗粒的组装影响病毒基因组复制，又能够导致对HBV感染肝细胞内共价闭合环状DNAcccDNA合成和转录活性产生多重影响。.课题研究期间，申请者基于体外溶液模型、HBV瞬时转染细胞模型、HBV稳定表达细胞模型、HBV感染细胞模型和HBV慢性感染小鼠模型，对GLS4抗病毒活性、抗病毒分子机制和耐药屏障等方面进行了深入评价。研究结果提示，GLS4在各种细胞模型和动物模型中均表现出较强的抗病毒活性；体外溶液模型、细胞模型中观察到GLS4不仅干扰病毒核心颗粒组装，还可对已组装的核心颗粒产生破坏作用，进一步实验证实GLS4可导致裂解的核心颗粒为包含双链DNA基因组的成熟核心颗粒。由于GLS4对核心颗粒的这种双重作用，其可较核苷类似物具有更好的抑制cccDNA从头合成的能力，在HBV感染细胞模型中进一步证实，GLS4预处理可强力阻断新感染细胞内cccDNA的合成，而核苷类似物恩替卡韦不具有此活性。GLS4在细胞模型中，并未影响宿主抗病毒先天免疫应答和cccDNA转录活性。申请者进一步评价了HBV核衣壳组装调节剂和核苷（酸）类抗病毒化合物热点耐药变异对GLS4敏感性的影响，通过对HBcAg药物结合部位关键氨基酸天然突变株的筛选和表型研究发现，GLS4对T33N和T109I两种点突变表现出体外敏感性降低，为该类药物结构优化提供重要线索；进一步的耐药屏障研究提示，在长期病毒复制模型中，T33N耐药突变株较难建立起复制优势，且需达到90%以上的准种比例时才能表现出表型耐药，提示GLS4具有较高的耐药屏障。.本研究系统深入地评价了GLS4抗乙型肝炎病毒活性、抗病毒分子机制和耐药屏障，研究成果将为GLS4 及同类化合物的结构优化和后续临床研究提供重要指导信息，提升我国抗HBV药物的研发能力。