一种新型非核苷类乙型肝炎病毒核心颗粒聚合抑制剂体内抗病毒活性及作用机制

The nucleos(t)ide analogues are highly effective in the anti-HBV treatments. However, these therapies are limited by the substantial resistance of the virus to nucleosidic inhibitors. Therefore, new efficacious anti-HBV drugs with novel modes or targets of antiviral actions are highly desired. In our previous study, GLS4, a member of heteroaryldihydropyrimidines, was discovered as a highly potent non-nucleosidic inhibitor of HBV in vitro. GLS4 treatment caused a dose-dependent inhibition of HBV core particle formation in HepG2.2.15 cells and was equally effective in inhibiting replication of both wild-type and ADV-resistant HBV strains. These indicated a different action mode of GLS4 compared with NAs. In this project, we will further determine the antiviral effect of GLS4 in vivo in a HBV-transgenic mouse model and elucidate the detailed antiviral mechanism of GLS4 by the X-ray crystallography technology. GLS4 is a novel compound with independent intellectual property rights, and elucidation of the anti-HBV mechanisms will provide ideas and research foundation in developement of new antiviral drugs.

核苷(酸)类似物作为慢性乙型肝炎抗病毒治疗的主要药物，伴随其广泛的应用从而导致针对该类药物耐药问题的出现，极大限制了此类药物的应用，并增加了慢性乙型肝炎临床治疗的难度。因此，目前亟需发展具有全新作用机制和作用靶点的抗乙型肝炎病毒(HBV)药物。我们前期体外研究结果表明，异芳基二氢嘧啶类化合物GLS4作为一种新型的非核苷类抗HBV小分子化合物具有高效抑制HBV复制的作用，该化合物可呈剂量依赖性减少HepG2.2.15细胞中核心颗粒水平，并有效抑制阿德福韦耐药HBV病毒株的复制，具有与核苷类似物完全不同的全新作用机制。本课题拟利用HBV转基因小鼠模型对GLS4体内抗HBV活性进行评价，同时利用结构生物学的方法初步确定其作用位点，对抗病毒分子机制进行探讨。GLS4是我国自主研发的具有完全自主知识产权的新型化合物，对其抗HBV分子机制及确切作用位点的阐明将为抗病毒药物的开发提供思路及相关研究基础。

异芳基二氢嘧啶类化合物GLS4作用于乙型肝炎病毒（HBV）核心颗粒，导致病毒核心颗粒错误组装，具有不同于核苷类似物的抗病毒作用机制。体内研究结果显示，GLS4呈量效性减少HBV转基因小鼠血清和肝内HBV DNA，联合用药比单独给予拉米夫定更有效减少肝内HBV DNA，GLS4呈剂量依赖性减少小鼠肝内HBV核心颗粒及核心蛋白，肝细胞HBcAg表达水平显著下降。我们构建截短型Cp149、全长型Cp183、突变型Cp149-Y132A和Cp183-Y132A四种质粒在大肠杆菌中进行表达和纯化HBV核心蛋白，并通过ITC检测GLS4与病毒核心蛋白的相互作用。结果显示Cp149形成240聚体结构，Cp149-Y132A形成二聚体结构，而Cp183和Cp183-Y132A形成不均一的高聚体。体外实验没有检测到Cp149、Cp149-Y132A与GLS4的相互作用。将GLS4分别与Cp149和Cp149-Y132A共浸泡进行晶体生长，结果发现Cp149-Y132A-GLS4可长出晶体，但是晶体质量不足以获得衍射数据。我们证实GLS4可有效抑制转基因小鼠体内HBV复制，可作为单独或联合用药的备选药物用于慢性乙型肝炎的临床治疗。在后续实验中，我们将调整核心蛋白和GLS4的浓度检测相互作用，并优化条件提高晶体分辨率，进一步分析其相互作用位点及阐明其抗病毒作用机制。