干扰素α抗乙型肝炎病毒机制中关键分子ISG15的发现和功能研究

慢性乙型肝炎严重危害人类健康。作为一线治疗药物，干扰素α的抗乙型肝炎病毒（HBV）作用通过免疫调节和直接抗病毒途径实现，但仅在30％患者中获得持续病毒学应答。目前关于干扰素α抗HBV的信号通路及关键分子尚未明确，HBV逃避干扰素抗病毒作用的机制同样缺乏深入研究。.我们前期实验证实了JAK-STAT通路介导干扰素α抗HBV的必要性；发现HBV前C区和BCP区变异株对干扰素α的体外敏感性显著降低；基因表达谱芯片和比较蛋白质组学研究筛选鉴定出ISG15可能是参与干扰素α抗HBV的关键干扰素刺激基因。本课题拟对ISG15在干扰素α抗HBV效应中的关键作用进行验证，阐述其抗病毒具体机制；并对其抑制HBV干扰素耐药株的能力进行评价。ISG15在干扰素α抗HBV中的作用尚未见报道，对这一可能的关键分子深入研究将有助于深入阐述干扰素介导的细胞内抗HBV机制，并为慢性乙型肝炎的治疗提供新的药物开发靶点。

本研究旨在对干扰素抗HBV作用中的关键信号通路和分子机制进行研究。结合前期研究工作基础，对ISG15 在干扰素α抗HBV 效应中的关键作用进行验证，阐述其抗病毒具体机制。实验结果表明，ISG15对HBV复制水平的抑制主要作用于复制中间体水平，能够有效地抑制HepG2.2.15细胞中HBV复制中间体的水平；ISG15蛋白水平在HepG2.2.15细胞中低表达；ISG15对HBV干扰素拮抗变异株的复制仍具有较强的抑制作用；表达谱芯片分析结果显示，ISG15过表达后，HepG2.2.15细胞上调3倍以上基因50个，下调基因87个。进一步进行KEGG信号通路分析，差异基因主要富集在PAMP受体激活通路、细胞信号转导、Wnt信号通路、MAPK信号通路、ECM受体相互作用和胰岛素信号通路等。进一步功能验证实验中，对 PAMP 受体通路中的差异基因IPS-1、TRIF和MyD88在hepG2和huh7两种肝癌细胞HBV瞬时转染模型中进行HBV抑制实验，观察到IPS-1、TRI和MyD88均可对HBV 有明显的抑制作用。上述结果表明，ISG15发挥抗病毒作用，有可能与其调控PAMP受体通路中的关键元件IPS-1、TRIF和MyD88相关，其进一步相互作用和调控机制将有待于进一步研究。. 为进一步对干扰素治疗慢性乙型肝炎机制进行研究，课题研究还增加了干扰素治疗慢乙肝患者的血清蛋白谱的研究。对干扰素治疗慢乙肝患者的血清蛋白谱的研究对发生/未发生血清学转换组的患者基线和治疗24周血清进行差异蛋白的筛选和鉴定，发现α-2-HS-糖蛋白在HBeAg血清学转换的患者中，与基线相比，治疗4周时83.33% 患者α-2-HS-糖蛋白水平显著上调, 16.67% 患者无显著性变化； 非HBeAg血清学转换患者中, 与基线相比, 治疗4周时52.17% 患者α-2-HS-糖蛋白水平显著下调，47.83%患者无显著变化。提示α-2-HS-糖蛋白水平动态变化对干扰素Alfa-2b治疗慢性乙型肝炎患者发生血清学转换中具有预测意义，下一步将针对这一蛋白在干扰素抗HBV的体内作用机制进行研究。. 综上，本课题按照任务书要求，对ISG15在干扰素抗HBV效应作用和分子机制进行了验证和探讨，并筛选得到干扰素Alfa-2b治疗慢性乙型肝炎患者血清学转换的血清标志物。