miRNA-148a负调控Wnt/β-catenin信号通路抑制肺癌细胞侵袭转移的实验研究

We have found that low expression of miRNA-148a was closely related to lymph node metastasis and poor prognosis in lung cancer tissues. MiRNA-148a could inhibit invasion and metastasis of lung cancer cells and downregulate Wnt1 protein expression and upregulate E-cadherin expression a key protein of epithelial-mesenchymal transition (EMT). We also showed that the methylation levels of miRNA-148a CpG sites in lung cancer tissues inversely correlated with miRNA-148a expression. So we proposed that miRNA-148a may negatively regulated Wnt/β-catenin signaling pathway to reverse EMT by inhibiting its direct target Wnt10B and potential target Wnt1 protein expressions, which in turn causes the inhibition of invasion and metastasis of lung cancer cells. And the dysregulation of miRNA-148a expression may due to the gene methylation. Here, we intend to use a series of methods such as exogenous transfection of miRNA-148a and construction of luciferase reporter genes to study roles and the regulatory mechanisms of Wnt/β-catenin signaling pathway in miRNA-148a-mediated EMT inversion and inhibition of invasion and metastasis in lung cancer cells. And we will also study epigenetic regulation mechanisms of DNA methylation which leads to dysregulation of miRNA-148a expression.

我们发现肺癌组织低表达miRNA-148a与淋巴结转移和预后差密切相关；miRNA-148a能够抑制肺癌细胞的侵袭转移和Wnt1蛋白的表达，上调上皮间质转化（EMT）关键蛋白E-cadherin的表达；我们还发现肺癌组织中miRNA-148a CpG 位点甲基化水平与其表达呈显著的负相关。因此，我们提出miRNA-148a可能通过靶向抑制其靶点Wnt10B和潜在靶点Wnt1的表达负性调控Wnt/β-catenin信号通路逆转EMT，从而抑制肺癌细胞的侵袭转移，其在肺癌中表达的失调可能与甲基化修饰有关。我们拟采用外源性miRNA-148a导入、构建荧光素酶报告基因等一系列研究方法，开展miRNA-148a逆转EMT及抑制肺癌细胞侵袭转移过程中Wnt/β-catenin信号通路所发挥的作用及其调控机制的研究，我们还将研究导致miRNA-148a表达失调的DNA甲基化修饰的表观遗传学调控机制。

在我们的前期研究工作基础上，我们建立一种假说：miRNA-148a可能通过调控Wnt蛋白（Wnt1与Wnt10B）的表达负调控Wnt/ß-catenin信号通路，从而逆转肺癌细胞EMT，抑制肿瘤细胞的侵袭转移。我们通过采用组织芯片、外源性miRNA-148a导入、双荧光素酶报告系统、siRNA技术等一系列研究方法，开展miRNA-148a抑制肺癌细胞侵袭转移过程中的相关机制研究。我们的研究结果显示在肺癌组织中，miRNA-148a CpG 位点甲基化是miRNA-148a的低表达的一个重要原因，采用去甲基化剂能够使肺癌细胞的miRNA-148a的表达增高。在肺癌组织芯片中，miRNA-148a在肺癌组织中的表达显著低于癌旁正常组织，且与淋巴结转移及预后密切相关，miRNA-148a的表达与Wnt1的表达呈负相关。miRNA-148a能够抑制肺癌细胞侵袭转移，通过双荧光素酶报告基因及western blot显示Wnt1是miRNA-148a的一个直接调控靶基因。采用siRNA抑制Wnt1蛋白的表达后，细胞的侵袭转移能力也得到了抑制，这些结果说明miRNA-148a可能通过调控Wnt1的表达发挥抑制肺癌细胞侵袭转移的作用。我们在组织芯片的分析中也发现miRNA-148a的表达与Wnt10b的表达也呈负相关，生物信息学分析、双荧光素酶报告基因及western blot显示Wnt10b也是miRNA-148a的一个直接调控的靶基因。这些关于miRNA-148a在肺癌中的研究结果将非常有助于我们寻找新的靶向肺癌miRNA的治疗手段，进而达到抑制肿瘤转移的目的。