嘧啶核苷酸代谢途径改造及辅因子调控策略研究

本项目以面向工业生物过程的嘧啶核苷酸高效制备为研究目标，以开发拥有自主知识产权的生物催化剂为核心研究内容，针对代谢过程中代谢流在糖酵解途径和磷酸戊糖途径分配不合理的问题，提出了利用辅因子代谢工程解决该问题的新思路，采用导入辅因子再生途径或削弱竞争途径的策略调节胞内的NADPH/NADP和ATP/ADP，迫使代谢流发生迁移，以满足嘧啶核苷酸对前体物质PRPP的需求；针对传统筛选方法周期长、工作量大的弱点，采用数据探矿的方法开发新的催化剂；针对酶催化反应速率差异导致的速率不匹配问题，提出了调节SD序列和AS序列控制多顺反子元件表达和多质粒多诱导条件控制表达元件的方法，为多酶催化体系多基因的表达控制提供了新的解决方案。本项目的开展不仅能够实现嘧啶核苷酸的高效制备，还提供了一种调节代谢流分配的新思路，因此本课题的开展具有明显的应用前景和科学价值。

三磷酸胞苷（CTP）是嘧啶生物合成途径中极其重要的终产物，作为核酸的重要组成部分，是合成DNA、RNA、细胞膜磷脂、唾液蛋白的重要前体物质。为了能够实现从低成本化合物乳清酸高效制备CTP，本课题通过从谷氨酸棒杆菌ATCC13032中克隆了三条基因，分别是OPRTase的编码基因pyrE、ODCase的编码基因pyrF和CTPs的编码基因pyrG，并分别对其酶学性质进行了研究。. 通过合理设计多顺反子，将编码限速酶的基因放在离启动子较近的位置，并引入操纵子中SD序列和在SD序列和起始密码子AUG之间的区域（AS区域）等表达元件，成功地构建了多顺反子质粒pET28a-pyrE-pyrF，从而实现OPRTase和ODCase的差异表达，平衡反应速率。利用重组大肠杆菌pET28a-pyrE-pyrF全细胞催化合成UMP，反应16 h后UMP产量达到了1.76 g/L。. 同时，以大肠杆菌Rosetta-pet28a-pyrG和谷氨酸棒杆菌细胞协同作用，以乳清酸为底物成功合成了CTP，转化反应24 h后CTP的生成量达到了2.8 g/L，CDP的生成量为1.5 g/L，CMP的生成量为0.6 g/L，摩尔转化率为26%，实现了CTP的生物合成。. 研究期间以第一、共一、共通讯作者身份共发表SCI论文十三篇，申请专利8项，获授权4项，应邀参加德国KIT大学主办的中德研习会，并作分会场报告，获江苏省科学技术一等奖一项（排名第二），获江苏省六大人才高峰资助。