RXRα磷酸化在HBx蛋白上调肝细胞癌DNMT3a表达中的作用及其机制研究

Hepatocellular carcinoma（HCC） is the second leading cause of death for tumor in China and most of the patients are infected with HBV. In the previous study, we found that HBx protein can induce the promoter methylation of the tumor suppressor gene via increase DNMT3a expression, and further enhance the invasiveness of HCC, but the mechanism is unclear. RXRα which predominantly expressed in the liver may be involved in the regulation of DNMT3a with RARβ / RXRα dimer form in the embryonic stage according to the resent reports. We have confirmed that the transcriptional activity of DNMT3a promoter was down regulated by RXRα in HCC cell lines. Additionally, it was found that RXRα protein was generally in abnormal phosphorylation in HBV-related HCC, which was associated with poor prognosis. So that We hypothesized: RARβ / RXRα dimmer might play a negatively regulatory role both in the transcription and protease activity in DNMT3a. While HBx proteins induced phosphorylation of RXRα protein in serine 260 through Ras/MAPK pathway, So that RXRα could not form a normal structure and function of the RARβ / RXRα dimer, and then the expression of DNMT3a was upregulated. This study will help to deepen the understanding of the mechanism of HBV promoting the carcinogenesis of HCC, and to find a new target for prognosis assessment and intervention in HBV related HCC.

肝癌是我国肿瘤第二大死因，绝大多数患者合并HBV感染。前期研究发现HBx蛋白通过上调DNMT3a表达，诱导抑癌基因启动子甲基化，增强肝癌侵袭性，但调控机制不明。新近文献提示肝组织中优势表达的RXRα蛋白可能在胚胎期以RARβ/RXRα二聚体形式参与DNMT3a调控。我们初步证实转染RXRα可显著下调肝癌DNMT3a启动子转录活性。同时，临床研究发现HBV相关肝癌标本中，RXRα蛋白普遍处于异常磷酸化状态，磷酸化程度越高预后越差。由此我们推测：RARβ/RXRα二聚体可能在DNMT3a的基因转录活性和蛋白酶活性层面都对其具有负性调控作用；HBx蛋白通过Ras/MAPK通路诱导RXRα蛋白S260位磷酸化，使其无法形成正常结构和功能的RARβ/RXRα二聚体，从而上调DNMT3a表达。本研究有助于深化理解HBV促进肝细胞癌发生发展的作用机理，并为肝细胞癌寻找一种预后评估及干预的新靶点提供帮助。

在前期研究发现的HBx蛋白上调DNMT3a表达，介导抑癌基因启动子的甲基化和增强肝癌侵袭性的基础上，本项目通过分析乙肝病毒阳性（HBV+）肝细胞癌患者的临床样本发现在HBV+肝细胞癌患者肝癌组织中HBx蛋白与RXRα、RXRα与DNMT3a的基因和蛋白表达均呈显著负相关。机制研究发现在SMMC-7721细胞中过表达HBx可显著抑制RXRα的蛋白表达而促进DNMT3a的蛋白表达。而在HBx过表达的SMMC-7721细胞中同时过表达RXRα则可逆转HBx引起的DNMT3a蛋白升高，说明HBx通过抑制RXRα蛋白表达而实现其上调DNMT3a的作用。 进一步机制研究发现MKK/MEK抑制剂PD98059和p38 MAPK抑制剂SB203580可显著逆转HBx对RXRα表达的抑制作用，说明HBx蛋白通过MKK/MEK和p38 MAPK信号通路抑制RXRα的表达。因此本项目研究阐明HBx通过MKK/MEK和p38 MAPK信号通路抑制RXRα的表达，继而解除RXRα对DNMT3a的抑制作用。 .除了完成预定研究计划外，我们还额外完成了以下发现： （1）我们利用大数据分析方法发现了HBV+肝癌患者由肝硬化、早期肝癌向晚期肝癌进展过程中三个关键的lncRNA（lncRNA LINC01018、EHHADH-AS1、F11-AS1）。继而通过引入竞争性内源RNA (ceRNA) 假说，构建了由肝硬化、早期肝癌向晚期肝癌进展过程中的95个ceRNA网络，并通过实验证实了EHHADH-AS1 - hsa-miR-4459 - ENTPD5 ceRNA网络的存在。机制研究发现lncRNA EHHADH-AS1可以抑制肝癌细胞的活性、增殖和凋亡，对于维持肝癌细胞的静息态具有非常关键的作用。（2）通过对公共数据库中7个HBV+的肝细胞癌数据集进行了集成分析并联合COX回归分析，得出由SPP2, CDC37L1 和ECHDC2构成的3基因预后标签，有望将其发展为HBV+肝细胞癌的独立预后因子。.在该课题资助下，进行了较广泛的学术交流与合作（多人次参加国际、国内学术会议）；培养了1名博士后、1名博士，目前在读研究生5名；已发表论文6 篇（其中SCI 收录刊物3 篇（其中影响因子大于3分的1篇），在中文核心期刊发表论文2篇,统计源期刊1篇。应邀作全国学术大会报告3次。