内皮生长晕细胞对大鼠脑出血后脑损伤的保护作用及机制研究

Intracerebral hemorrhage (ICH) constitutes one of the most devastating forms of stroke, and no effective treatment strategy is currently available. The early enlargement of hematoma, which is the main cause of brain injury exacerbation after ICH, is closely related to brain edema. And one of the main mechanisms is the damage of blood brain barrier (BBB). Endothelial progenitor cell (EPC) that could differentiate to an endothelial-like phenotype provided a promising new cell source for endothelialization. Among the phenotypically and functionally diverse progeny of EPC, endothelial outgrowth cell (EOC) is particularly promising for vascular tissue engineering applications. We have successfully isolated and characterized EOC from human umbilical cord. The rat ICH model was also successfully induced. Our preliminary experiments found that EOC treatment could attenuate brain injury after ICH in rats. However, the mechanism is not known. The objective of this project is to further prove the effect of EOC on the rat ICH model and choose the optimal treatment time by applying cells at different time points after ICH. The change of brain edema is evaluated by measuring the water content of the brain tissue．The permeability, ultrastructure change, and the expression of occludin protein of the BBB are observed to discuss the mechanisms of the protective effect.

脑出血（ICH）致死致残率高，临床上缺乏特异的治疗方法。ICH患者早期病情恶化多由血肿扩大引起，脑水肿与早期血肿扩大密切相关。而血脑屏障破坏是加重脑水肿的主要机制之一。内皮祖细胞（EPC）成熟后成为内皮细胞，是血管系统重要的组成部分。内皮生长晕细胞（EOC）是EPC的亚型之一，在修复血管内皮及血管形成方面有显著优势，理论上对破坏的血脑屏障有修复作用。我们预实验发现大鼠脑出血后12小时给予EOC可改善神经功能缺损，但具体机制不清楚。本研究拟通过观察ICH大鼠脑水肿程度变化、血脑屏障通透性变化、血脑屏障超微结构和细胞器变化以及紧密连接蛋白occludin表达改变等，探讨EOC对ICH治疗作用的基本机制，以期为发现ICH特异有效的新方法提供理论依据。同时，通过不同干预时间研究最佳治疗时机，为临床治疗提供参考。

项目背景：自发性脑出血（Intracerebral hemarraghe，ICH）致死致残率高，其病理生理机制十分复杂，其中脑水肿形成是重要机制之一，与48小时内血肿扩大密切相关。内皮祖细胞（Endothelial progenitor cell，EPC）是存在于外周血中的不成熟的内皮细胞。研究发现脑出血患者外周血EPC数量升高，且与患者预后相关。本研究观察了EPC对脑出血模型大鼠保护作用，探讨了相关机制，包括对脑水肿的影响，对炎症因子的作用及对血脑屏障的修复功能。.主要研究内容：首先，分离、鉴定大鼠骨髓源性EPC，通过尾静脉注射，观察EPC对大鼠脑出血模型的保护作用；此外，通过测量大脑半球水含量的变化，观察对脑水肿的影响；通过计算脑组织伊文思蓝含量，及western blot 检测紧密连接蛋白ZO-1及Claudin-5的含量变化观察对血脑屏障的影响。通过免疫荧光标记示踪的方法观察EPC在脑中的分布；通过TUNEL检测EPC对细胞死亡的影响；通过ELISA检测对炎症因子的影响；通过western blot检测对神经保护因子的影响。.重要结果：大鼠ICH 24h后，可在脑组织内发现标记的EPC。与PBS组相比，EPC组大鼠神经功能缺损评分明显改善，脑水肿明显减轻。TUNEL检测显示EPC组脑组织血肿周围死亡细胞数明显减少。EPC组伊文思蓝通透性降低，紧密连接蛋白Claudin-5和ZO-1表达增加，提示EPC对破坏的血脑屏障有修复作用。与PBS组相比，EPC组促炎因子IFN-γ, IL-6 及TNF-α表达下降，抗炎因子TGF-β1 及 IL-10表达上调，EPC组神经保护因子VEGF、NGF、BDNF表达升高。由以上结果得出，EPC对脑出血大鼠有神经保护作用，其作用减轻炎症反应、促进神经保护因子分泌、修复破坏的血脑屏障，减少细胞死亡相关。.科学意义：证实了EPC对大鼠脑出血的保护作用，并阐明了对出血后脑水肿及炎症反应的影响，证实了对血脑屏障的修复作用。为脑出血的神经保护治疗提供了新的思路和依据。