miR-326调控Th17细胞分化在实验性自身免疫性葡萄膜炎发病中的作用研究

Th17细胞在自身免疫性葡萄膜炎的发病中起着关键性的作用。研究表明，微小RNA-326（miR-326）对Th17细胞的分化有着重要的调控作用。我们在以前工作的基础上，诱导实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）动物模型，检测miR-326水平；构建慢病毒miR-326过表达载体，同时以反义寡核苷酸阻断miR-326的功能，应用Northern blot、定量PCR、荧光原位杂交、Western blot、流式细胞术、ELISA、过继转移、淋巴细胞增殖实验等方法观察过表达和抑制miR-326对Thl7细胞分化的调控以及对EAU发病的影响，研究miR-326的靶基因及其作用机制。此项研究旨在揭示miR-326对机体细胞免疫反应的影响及其在自身免疫性葡萄膜炎发病中的作用，将为我们探索自身免疫性疾病复杂发病机制提供新的思路和理论依据。

探讨微小RNA-326（miR-326）对Th17细胞分化的调控以及对自身免疫性葡萄膜视网膜炎发病的作用。我们合成了IRBP R16多肽片段，纯度为98.71%，联合免疫佐剂诱导实验性自身免疫性葡萄膜视网膜炎（EAU）动物模型，进行临床观察和病理分级。应用定量PCR法检测EAU大鼠不同时间点视网膜组织的miR-326水平，ELISA法检测EAU大鼠Th17细胞特征性细胞因子白细胞介素-17（IL-17）水平。结果表明，在诱导EAU动物模型后的第11、14、17天，视网膜组织的miR-326水平与管家基因相比明显升高，差异有统计学意义。房水、脾细胞和引流淋巴结细胞培养上清液的IL-17水平也明显增高。为了验证miRNA的生物学效应，采用功能缺失试验，即反义寡核苷酸阻断特异性miRNA 的功能，从而使过量表达的miRNA得到抑制，观察其对疾病的影响。我们构建了miR-326反义寡核苷酸和无义对照序列，特异性阻断miR-326的功能，观察抑制miRNA-326对大鼠IL-17水平的影响，评价其对于EAU发病的作用。结果表明，抑制miRNA-326后，EAU大鼠的临床症状减轻，病理分级下降，IL-17水平降低。我们还进行了另外一项研究，采用薄膜水化法构建了包载抗体的长循环脂质体，检测其表征，进行稳定性考察。体外释放试验结果表明，长循环脂质体中的抗体在180小时内累计释放百分率小于70％，表明长循环脂质体可显著减慢抗体的体外释放；进行体内实验，结果显示，玻璃体腔内注射抗体后，大鼠玻璃体腔内抗体浓度迅速下降，在注射后第7天起即不能检测到，而玻璃体腔内注射载抗体的脂质体后，直到第60天仍然可以检测到抗体的存在。制备罗丹明标记的载抗体脂质体，将其注入大鼠玻璃体腔内，对大鼠眼球进行了冰冻切片，在荧光共聚焦显微镜下观察发现，注射后第60天，仍可见视网膜内部有罗丹明标记的脂质体颗粒存在。我们检测了包载抗体的长循环脂质体对EAU大鼠的治疗作用，发现玻璃体腔内注射载抗体脂质体能够长期有效地减轻眼内炎症的严重程度。