超声靶向破坏微泡增强AAV转染率的胞内运输动力学机制及优化效应研究

腺相关病毒（AAV）是一种在安全性及表达时效性上具有突出优势的病毒载体，但其转染率在不同组织细胞差异显著。传统提高AAV转染率的方法缺乏安全性及存在细胞选择性。课题组前期研究发现超声靶向破坏微泡（UTMD）技术可安全有效提高AAV在不同组织细胞的转染率且加速基因表达，转染率最高达50-60%。目前研究遇到难题是如何进一步提高AAV转染率？明确其机制是解决问题的突破口。从前期研究中申请者提出假说：UTMD提高AAV转染率的胞内机制是促进了AAV从胞浆到核仁的运输。本课题拟采用荧光标记、Real-time PCR及RNAi等方法，以早期及晚期胞内体标志物Rab5及Rab11、核孔复合物gp210和P62及AAV衣壳和DNA为研究对象，探索UTMD技术对AAV在胞内体及入核时的运输动力学的影响，找到优化UTMD实施条件的新方法，以期进一步提高AAV转染率,为UTMD及AAV拓展应用提供新的思路。

重组腺相关病毒（rAAV）较之目前用于基因治疗的其他病毒载体，具有安全性好及介导基因长期稳定表达的突出优势，但在不同组织细胞rAAV转染效率差异显著，限制其在机体的广泛应用。课题组前期研究发现，利用超声靶向破坏微泡技术 (UTMD) 能够安全有效提高rAAV在亲和组织视网膜的转染效率。那么在rAAV的非亲和组织，UTMD能否同样提高其转染率，背后的机制又为何？本研究对这些问题进行了深入探索研究。首先，选择亲和性极低的小鼠成纤维细胞（NIH/3T3）及人肾癌细胞（786-0、OS-RC-2），优化UTMD条件并介导携带绿色荧光蛋白报告基因（EGFP）的血清2型rAAV进行转染，结果发现，UTMD提高了rAAV2-EGFP在上述非亲和细胞转染效率1-3倍，提高效果稳定维持5天。继之在裸鼠肾癌动物模型上UTMD更为显著地促进rAAV2的转染，增强效果稳定维持12周。Real-time PCR结果显示，与对照组相比，在体外rAAV2的基因拷贝数经UTMD介导后最高可提高约9倍，在体内提高约2倍，以此解释了UTMD增强效果稳定维持的原因。此外，体内动物模型实验还发现UTMD增强rAAV转染的同时抑制了肿瘤生长。接下来，我们以网格蛋白介导的细胞内吞作为研究对象，采用免疫荧光，Real-time PCR，Western Blot及电镜等手段来研究UTMD增强rAAV转染HeLa细胞的胞内运输动力学改变，结果发现，UTMD可刺激细胞网格蛋白介导内吞的活跃程度，包括内吞泡的形成，网格蛋白的增多；进一步抑制网格蛋白作用后，UTMD对rAAV转染的增强作用部分抑制，表明UTMD刺激细胞内吞是其促进细胞摄取载体的机制之一。本研究证实了UTMD可以增强rAAV在非亲和组织的转染率，且进一步探索出相应的胞内生物学机制，这些成果有望为rAAV基因治疗建立新技术平台奠定基础。