超声靶向微泡破坏增强抗生素活性治疗生物膜相关感染的实验研究

Biofilms are the important cause of persistent infections in clinical practice, especially on implanted medical devices, such as artificial heart valves, vascular catheters and prosthetic joints. Resently, our study showed that ultrasound-targeted microbubble destruction (UTMD) could enhance the activity of vancomycin against Staphylococcus epidermidis RP62A biofilms. To explore a new noninvasive and targeted approach to cure biofilm infection, in this study, the biofilms of staphylococcus aureus and pseudomonas aeruginosa and two antibiotics were selected, and UTMD was used to enhance the activity of the two type of antibiotics against biofilm. (1) To elucidat the mechanism, the morphology of biofilms were examined with macroscopy, light microscopy (LM), confocal laser scanning microscopy (CLSM), scanning electron microscopy (SEM) and transmission electron microscopy (TEM). After UTMD, the autolysis assay and cell permeability experiments of the biofilm's bacteria were performed. (2) The relationship of the enhancement of antibiotic activity with the key ultrasound parameters (the acoustic intensity, duty cycle and duration) would be explored by experiment of changing those parameters. Thereafter, a mathematic model would be built to obtain the optimal parameters via measurement the biofilm density and a series of procedure such as the biofilm density, LM, CLSM, SEM and TEM.

生物膜形成导致细菌耐药是临床慢性感染久治不愈的重要原因，尤其在移植物相关感染方面，目前仍缺乏有效的治疗方法。我们近期的研究表明超声靶向微泡破坏（UTMD）可显著增强万古霉素活性对抗表皮葡萄球菌生物膜。本项目拟采用2种临床常见的生物膜感染细菌（金黄色葡萄球菌和铜绿假单孢菌），分别选用两种不同杀菌机制的抗生素，联用UTMD技术作用于这两类细菌的生物膜，通过：（1）扫描电镜和透射电镜观察生物膜细菌的形态与超微结构改变，以及细菌自溶能力与细胞膜渗透性实验等，阐明UTMD提高抗生素抗生物膜能力的可能机制；（2）改变超声剂量、辐照时间和微泡浓度等参数，经光密度测定、光镜、激光共聚焦和电子显微镜检查生物膜形态变化，结合存活菌CFU计数了解细菌存活状态，探明抗生素活性提高程度与超声剂量、辐照时间及微泡浓度等参数的相关性，并建立数学模型，计算最佳的组合参数，为生物膜相关感染探索一种新的非损伤性靶向治疗方法。

背景：生物膜的形成增强了细菌的耐药性，是临床慢性感染久治不愈的重要原因，尤其在人工心脏瓣膜、血管导管及关节假体等移植物相关感染方面，目前仍缺乏有效的治疗方法。超声（US）作用于生物组织可产生生物效应，其与抗生素联用可提高其抗生物膜的活性。超声靶向微泡破坏（UTMD）有可能更加增强抗生素活性治疗生物膜相关感染。.目的：探讨US及UTMD联合2种不同作用机制抗生素治疗2种细菌（金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌）生物膜相关感染的效果及可能机制，为此类生物膜相关感染探索一种新的非损伤性靶向治疗方法。.方法：采用金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌 2 种临床常见的生物膜感染细菌，分别选用两种不同杀菌机制的抗生素（万古霉素-氨基糖甙类和左氧氟沙星-喹诺酮类），联用UTMD 技术作用于这两类细菌的生物膜，通过结晶紫染色后观察、光密度测定，STYO9/PI 双染激光共聚焦显微镜以及扫描电镜和透射电镜等观察生物膜及其细菌的形态与超微结构改变，检测UTMD 作用后生物膜细菌自溶能力与细菌细胞膜渗透性改变，结合STYO9/PI 双染激光共聚焦扫描显微镜观察与存活菌CFU 计数实验了解UTMD 联合抗生素处理后生物膜内细菌的存活状态。.结果：光镜：与对照组比较，US及UTMD均可在生物膜上产生微孔，微孔的大小与声强大小呈正相关关系。同一声强，UTMD产生的微孔较单纯US条件下的微孔要大（P＜0.05）；扫描电镜进一步证实上述结果，并发现UTMD组的细菌形态发生改变，金葡菌表面出现小的突起。透射电镜观察到细菌细胞壁表面毛糙，并有碎裂及部分细菌内容物消失。两类细菌的UTMD组的细胞通透性较对照组及超声组显著增加（P＜0.05），对照组与超声组无显著差异（P＞0.05）。自溶实验表明UTMD组的两种细菌的自溶死亡较对照组及超声组显著增加（P＜0.05），对照组与超声组无显著差异（P＞0.05）。激光共聚焦扫描显微镜结果显示：超声+微泡+万古霉素组及超声+微泡+左氧氟沙星组的生物膜死菌数要显著多于其他各组（P＜0.05）。荧光定量分析及CFU计数实验进一步证实了上述结果。.结论：(1)US及UTMD均可在生物膜上产生微孔；（2）UTMD可导致细菌细胞壁等超微结构改变，增加菌细胞通透性，促进细菌自溶；（3）UTMD能有效增强万古霉素及左氧氟沙星抗生素活性杀灭金葡菌和铜绿假单胞菌生物膜内细菌。