基于基因组条形码技术的结核分枝杆菌诊断靶标的高通量筛选及功能研究

结核病诊断目前主要靠涂片、培养、X线、CT、血沉等系列检查的综合分析，发现率仅为29%，不能应对结核的再发与防控，已成为结核研究倍受关注的重大公共卫生问题。结核分枝杆菌难以建立现代检测技术的主要瓶颈为流行株种类多、变异快、结构复杂，无特异性抗原与理想的分子标志物，无快速可靠的临床检测技术。寻找特异性的分子靶标已成为基因检测的关键环节，也是早发现早治疗控制结核蔓延的关键步骤之一。利用基因组条形码新技术，对结核分枝杆菌基因组结构进行可视化注释及核酸片段功能区域的分析、实现对结核病原菌理想诊断靶标的高通量筛选。通过构建结核分枝杆菌诊断靶标系统注释平台及方便快捷的网络查询系统，实现实时的更新与互动，为临床的诊断、治疗、耐药等问题提供实用的工具。本项目应用现代计算技术与生物学技术交叉研究的新路径，解决以往单一学科无法攻克的结核诊断中的难题，开创感染性疾病诊断研究的新领域。

本项目构建了结核分枝杆菌基因组条形码可视化平台，通过异常条形码区域欧式距离的计算及筛选，实现了对结核分枝杆菌重要诊断靶标毒力岛的泛基因组扫描。功能分析显示：MPI-2编码VII型分泌系统；MPI-3主要参与细胞壁中霉菌酸的合成及与宿主细胞的相互作用；MPI-1的功能目前尚不清楚，但是通过蛋白结构域分析显示，此毒力岛上的结构基因与结核分枝杆菌的持续性感染密切相关，以上3个毒力岛可作为结核分枝杆菌重要诊断靶标。在此基础上，收集了318组结核分枝杆菌已知的代谢调控通路，通过pathway富集偶联技术筛选得到122个重要的代谢调控中枢分子，在结核分枝杆菌的代谢调控及生命周期中具有重要作用。我们通过对筛选基因侧翼序列1500bps 内的转座子、整合子及其他可移动元件判断其稳定性，基因Rv1513、Rv1974 和 Rv3738具有保守侧翼，因此可作为候选结核分枝杆菌诊断靶标。我们通过大规模的临床菌株对筛选到的3个候选诊断靶标进行验证，通过结果可以看出这3个基因的阳性率是100%。我们又对与结核病症状很相似的疾病(哮喘、肺炎、肺癌)进行了PCR法验证，结果发现100%阴性。这就说明我们通过泛基因组高通量筛选到的基因，其仅仅在结核分枝杆菌中存在，而在其它病菌及非结核病的病原菌中是不存在的。本项目在国家自然基金委的资助下，按计划完成的所有的工作。通过项目的实施共发表sci文章6篇，2次在国内学术会议中进行大会交流，培养博士研究生2名，硕士研究生2名。