角质酶降解高分子聚酯过程中结合底物的分子机制研究

In recent years, cutinase has been found to have degrading ability on a variety of crystalline polyester. Its ester bond cleavage mechanism is considered to be similar with that of lipid substrate degradation. However, it is not clear how the cutinase adsorb to the solid polyester substrate and then bind the active center to catalyze the degradation without the aid of the substrate binding domain. On the basis of previous studies, we propose the hypothesis that the process of binding of cutinases to polyester substrates such as PCL, PBS can be decomposed into three stages of adsorption, deconstruction of the crystal region, binding of the enzyme active site with the polymer chain. Then two cutinases was studied to investigate these stages. Based on the simulation of the interaction between the enzyme and the substrate, mutants in key amino acids and regions will be constructed. Each stage the cutinase and mutants binding the polymer substrate will be detected by polymer physical and chemical methods. The aim of the study is to clarify the molecular mechanism of the binding of cutinase to the polyester substrate. At the same time, the effect of adding ecdemic substrate-binding domain on the function of cutinase will be also discussed. The results will lay the foundation for the degradation, modification and recycling of natural and synthetic polyesters, and provide theoretical and experimental evidences for improving the efficiency of polyester degradation by cutinase based on protein modification.

近年来角质酶被发现对多种结晶性高分子聚酯具有降解活性，研究显示其催化酯键断裂机制与降解脂类底物是相同的；但作为一种单结构域酶，角质酶如何在没有底物结合结构域辅助的情况下与固相聚酯底物吸附结合进而发挥降解作用，目前尚不清楚。申请人在前期研究基础上，提出角质酶与PCL、PBS等聚酯底物结合的过程可分解为吸附、结晶区解构、酶活性位点与分子链结合三个阶段的假设；并以结构明晰的角质酶为对象，基于酶与底物相互作用的模拟，构建关键位点及区域的突变体，利用高分子化学的分析检测手段对角质酶及突变体结合高分子聚酯底物的每个阶段进行精细表征，明晰角质酶吸附、解构结晶区及与分子链结合的结构基础，阐明角质酶与聚酯底物结合的分子机制；同时进一步探讨添加底物结合结构域对角质酶功能的影响及分子基础。研究结果将为天然及合成聚酯的降解、修饰及循环转化奠定基础，也为基于蛋白质改造的角质酶降解聚酯效率的提升提供理论和实验依据。

进入21世纪以来，迫于资源与环境的压力，天然及人工合成高分子聚合物的降解和转化成为人们关注的热点，而生物酶解目前被认为是应用于该领域的最具潜力的方法。角质酶是近年来发现的聚酯降解酶类，由于其对多种聚酯具有降解能力，具有广阔的应用前景。虽然关于角质酶催化断键的机制已经有所了解，但底物尤其是不溶性聚酯底物如何与角质酶结合，并进入到催化中心的人们还并不清楚，而这一过程往往是不溶性结晶底物降解的关键限速步骤。. 本项目针对这一问题，以聚己内酯（PCL）和聚丁二酸丁二醇酯（PBS）为模式底物，以结构清晰的真菌和细菌来源的角质酶为对象，将酶与底物结合过程分解为吸附、解链、分子链结合这三个步骤，采用酶分子生物学及高分子化学的检测方法对角质酶及其突变体结合高分子聚酯底物的过程进行研究。明确了角质酶主要通过活性中心周围第二和第三个Loop上的疏水性氨基酸完成对固相底物的吸附，依靠关键氨基酸及loop摆动形成吸附面，从而保证吸附的有效性。角质酶不以无活性小分子蛋白形式参与结晶性聚酯的解链过程，聚酯解链随着酶解过程进行，材料特性及酶解条件对结晶区打开具有重要影响。角质酶依靠不同作用力与不同底物进行结合，对于短链底物，空间位阻越小越有利于酶与底物结合，同时活性部位周围的疏水环境有利于小分子短链底物的进入；对于中长链脂肪族聚酯，在酶与底物结合的过程中，去除氨基酸构成的网守结构，有利于酶与长链聚酯结合；空间位阻和疏水作用在酶促反应过程中仍共同发挥作用，但影响不如对短链底物的显著。添加底物结合结构域可能改变角质酶对固相底物的吸附能力或对分子链进入酶活性口袋发挥一定的辅助功能，但这种变化并非简单的加和关系，与结构域的类型、大小及连接位置等因素相关。 . 研究结果阐明了角质酶降解高分子聚酯过程中结合底物的分子机制，为合成聚酯的降解、修饰及循环奠定了基础，为角质酶的蛋白质工程改造及实现其它天然或非天然底物及产物的生物转化提供了可参考的信息。