ClpP蛋白酶对牙龈卟啉单胞菌生物膜调控机制的研究

Many studies have shown that Clp (caseinolytic protease, Hsp100) family of various pathogens has a regulatory role of biofilm formation, and ClpP protease is the core member of the caseinolytic protease family. Infections caused by Porphyromonas gingivalis (P.g) are mainly characterized by biofilm formation. Multiple virulence factors are also secreted and expressed in the biofilm. However, to our knowledge there are little reports about the role of ClpP protease of P.g in biofilm formation or related regulatory mechanisms. Our previous study found that the expression of ClpP protease in high virulent strain P.g W83 was much higher than that of low virulent strain P.g ATCC33277. Thus, it was presumed that ClpP protease might affect P.g virulence including biofilm formation ability; and the biofilm formation of P.g maybe regulated by ClpP protease possibly via affecting stability and expression of biofilm-associated factors. In this study we intend to construct a △clpP mutant strain and a complemented mutant strain C△clpP, build a biofilm model in vitro, assess the impact of ClpP protease of P.g on biofilm formation ability, and using Biofilms Ring Test, Confocal Scanning Laser Microscopy and Raman Spectroscopy. Real-time Quantitative PCR, Western-blot and other methods were used to explore possible regulatory mechanisms. What we found will provide an experimental evidence for elucidating the pathogenesis of P.g and provention of diseases caused by P.g.

丝氨酸蛋白酶(caseinolytic protease，Clp)家族对多种致病菌的生物膜形成有调控作用，ClpP蛋白酶是其家族核心成员。ClpP蛋白酶对牙龈卟啉单胞菌(P.g)生物膜形成的具体影响和调控机制尚不明了。本课题组前期研究发现ClpP蛋白酶在高毒力菌株P.gW83的表达量远高于在低毒力菌株P.gATCC33277的表达量。由此推测：ClpP蛋白酶对P.g的生物膜形成能力有影响；ClpP蛋白酶可能通过影响P.g生物膜相关因子的稳定性和表达从而调控生物膜的形成。本课题拟构建△clpP突变株和C△clpP互补株；建立生物膜模型；利用生物膜定量分析仪、CLSM和拉曼光谱，评价ClpP蛋白酶对P.g生物膜形成的影响；通过实时荧光定量PCR、Western-blot等方法深入探索ClpP蛋白酶对P.g生物膜形成的分子调控机制。为P.g致病机制的阐明和相关的口腔及全身疾病的防控提供实验依据。

牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis, P.g）是公认的牙周病和牙髓根尖周病的重要致病菌之一，与全身性疾病：动脉粥样硬化、低体重早产儿和风湿关节病等也密切相关。P.g主要以生物膜的形式存在和发挥致病作用，生物膜状态下的P.g具有更强的生存能力和致病性。酪蛋白水解酶(Caseinolytic Protease，Clp)家族是广泛存在于生物体胞浆中、高度保守且表达广泛的ATP依赖的蛋白水解酶。ClpP蛋白酶是该家族核心成员，文献报道其不仅对维持机体正常代谢活动和适应各种应激反应起着重要作用，而且还能对病理状态下多种致病菌的生物膜形成进行调节。但有关ClpP蛋白酶对P.g生物膜形成的影响和调控机制尚不明了。本课题组前期研究发现ClpP蛋白酶在高毒力菌株P.g W83中的表达量远高于在低毒力菌株P.g ATCC33277中的表达量，推测ClpP蛋白酶对P.g的致病作用有影响。本课题的研究目的是评估ClpP蛋白酶对P.g的生物膜形成的影响能力，并深入探索其影响机制。通过同源重组技术成功构建P.g W83的∆clpP基因缺失株和C∆clpP回补株，并对三种菌株进行了分子生物学鉴定；体外成功构建了P.g W83的三种菌株的生物膜模型，利用扫描电镜对三种菌株形成的生物膜形态进行了观察和比较；利用激光共聚焦显微镜观察了不同菌株生物膜细胞和胞外基质的生物量；利用结晶紫染色定量检测了三种不同菌株的生物膜的总形成量；利用Real-time PCR检测了其相关调节基因，即黏附因子fimA/mfa1和密度感应系统luxS/AI-2的mRNA水平。定性和定量研究结果显示，与P.g野生株相比，∆clpP基因缺失株的生物膜形成能力显著降低，回补株的生物膜形成能力与野生株相比没有明显差异。此外，黏附因子fimA/mfa1和密度感应系统luxS/AI-2的mRNA水平在∆clpP缺失株中的表达量明显低于野生株，ClpP蛋白酶对黏附因子fimA/mfa1和密度感应系统luxS/AI-2的表达具有正调节作用，说明ClpP蛋白酶能够增强P.g W83的生物膜形成能力，当clpP基因缺失时，P.g的生物膜形成量显著减少。这为丰富P.g致病机制的研究和对其生物膜的控制提供了实验依据，未来将更深入探索其对多菌种生物膜的调控路径。