平目汤抑制Graves眼病小鼠眼眶脂肪积聚及介导脂肪细胞凋亡途径的研究

Graves' ophthalmopathy (GO) is one of major reasons of blindness in orbital disease. The inactive GO is a refractory disease which seriously affected the quality of life in patients, and there are no effective medical treatments at home and abroad. Over proliferation and apoptosis shortage in adipocyte are the main causes of lipid accumulation in orbit which is considered as one of the important pathological mechanisms of inactive GO. The previous randomized, double-blind clinical studies showed that Pingmu Decoction which was a tonifying qi, warming Yang, reducing phlegm, removing blood stasis drug, could effectively reduce the exophthalmus degree in patients with inactive GO and the total effective rate was 77.14%. The results of experimental research showed that Pingmu Decoction could effectively inhibit the proliferation and promote apoptosis in orbit adipocyte. Based on these studies, this project will further observe the influence of Pingmu Decoction treatment on the accumulation of orbit adipocytes in animal model of GO by the immunocyte transduction animal model of GO. We'll culture the orbit adipocyte ascertain the mechanisms of Pingmu Decoction promoting orbit adipocyte apoptosis,including mitochondria pathway, death receptor pathway, endoplasmic reticulum pathway and so on.The purpose of this study is provide a theoretical foundation for using warming yang method of traditional Chinese medical and the theory of phlegm and blood stasis,and laying the groundwork for the medical treatment in this disease.

Graves眼病为眼眶病中主要致盲原因之一，其中严重影响患者生命质量的非活动期Graves眼病属顽固性疾病，国内外尚无有效内科治疗方法。眼眶内脂肪积聚被视为非活动期Graves眼病的重要病理机制之一，而脂肪细胞发生过度增殖及凋亡不足是该病眼眶内脂肪积聚的主要原因。前期随机、双盲临床研究显示，益气温阳、化痰祛瘀的平目汤有效降低患者突眼度，总有效率77.14%。实验研究发现平目汤可有效抑制眼眶脂肪细胞增殖，促进眼眶脂肪细胞凋亡。在此基础上，本课题将进一步通过免疫细胞转导Graves眼病动物模型,观察平目汤对于Graves眼病动物模型眼眶内脂肪积聚的影响。通过细胞培养的眼眶脂肪细胞，研究平目汤促进眼眶脂肪细胞凋亡属线粒体、死亡受体、内质网等凋亡途径的一种或数种，探讨平目汤作用机制。为中医药温阳法及痰瘀理论治疗非活动期Graves眼病提供理论依据，为内科治疗该病奠定基础。

原代培养眼眶前脂肪细胞，诱导分化为成熟脂肪细胞，使用人 h TSHR 基因片段重组质粒基因免疫结合 ECM830 电穿孔的方法建立 Graves 眼病动物模型，探讨平目汤作用机制。观察平目汤对眼眶成熟脂肪细胞凋亡率的影响；测定fas 、fas L 、Chop和Capase-4 m RNA及蛋白表达的影响；观察造模后 、平目汤干预后BALB/c 小鼠血清 TRAb、甲状腺与眼球后组织病理；干预后眼球后脂肪细胞凋亡、眼球后脂肪细胞 bax、bcl-2、fas、fas L、chop、Caspase-12 m RNA 及蛋白表达。流式细胞术结果表明，与空白对照组比较，平目汤各组细胞凋亡率均升高（P<0.05），PCR 结果显示：平目汤各组对眼眶脂肪细胞的 fas、fas L m RNA 的相对表达量较空白对照组均有一定程度的升高，Western blot 结果显示，与空白对照组相比，除地塞米松组外，平目汤各组 Fas、Fas L蛋白、Chop、Capase 4 蛋白表达均上调，差异有统计学意义（P<0.05）。造模后小鼠眼球后脂肪组织占眼球重量百分比升高，TRAb 升高。病理显示甲状腺滤泡增生变大，部分滤泡腔内物质吸收，滤泡腔可见均匀红染的胶质，间质明显增多，有数量不等的淋巴细胞浸润，眼球后出现大量脂肪堆积和淋巴细胞浸润。平目汤不同剂量及地塞米松干预造模小鼠后，血清 TRAb 水平由低到高依次为：空白组<平中组<平低组<地塞米松组<平高组<模型组。甲状腺组织 HE 染色：模型组可见甲状腺淋巴细胞浸润，间质增生明显。平目汤干预后淋巴细胞浸润减少，地塞米松干预后甲状腺少量淋巴细胞浸润。眼球组织 HE 染色：与模型组相比，平目汤各组眼球后脂肪组织堆积减少，地塞米松组无明显改变各组小鼠眼球后脂肪细胞凋亡由低至高依次为：空白组<模型组<地塞米松组<平高组<平低组<平中组。与模型组及地塞米松组相比，平目汤各组眼球后脂肪细胞 Bax、Fas L、Chop、Caspase-12 m RNA 与蛋白表达水平升高。平目汤使眼眶前脂肪细胞的增殖受到抑制，使前脂肪细胞向脂肪细胞的分化能力降低；成功建立 了Graves 眼病 BALB/c 小鼠模型；平目汤可有效抑制眼球后脂肪组织的积聚，促进眼球后脂肪细胞的凋亡，其凋亡途径可能为线粒体途径、死亡受体途径与内质网途径共同作用。