H5N1亚型禽流感病毒HA糖基化位点对树突状细胞天然免疫的影响及其机制

Hemagglutinin (HA) glycosylation site change of H5 subtype avian influenza virus (AIV) results in different pathogenicity and innate immune response. During AIV infection, dendritic cells (DCs), as important antigen-presenting cells, play a key role in the regulation of innate immune response. However, the effect and mechanism that different glycosylation sites regulate innate immune function of DCs, remain unclear. In our study, main contents are as follows: (1) Compare the infection ability of rs-AIVs (Wide Type, 158N, and 169N reassortant H5N1 viruses were constructed by reverse genetics technology) on the mice/chicken DCs; (2) Compare the innate immune response levels of DCs induced by rs-AIVs, including phagocytosis, phenotype, activation, migration, cytokines, T lymphocytes proliferation and differentiation by AIV infected-DCs, and the infection and cytokines levels of airway epithelial cells, macrophages, and T lymphocytes by AIV infected-DCs; (3) The effect of sialic acid receptors on the innate immune response of DCs induced by rs-AIVs. (4) The effect of HA glycosylation site change on the recognition of viruses by C-type lectin receptors. Our study will lay the foundation for further clarifying pathogenesis mechanism of H5N1 AIV.

H5亚型禽流感病毒（AIV）可通过改变血凝素（HA）糖基化位点影响病毒对宿主的致病力及天然免疫水平。在AIV感染过程中，树突状细胞（DCs）除了作为抗原递呈细胞外，也是天然免疫调控的关键。然而HA糖基化位点的改变对DCs天然免疫功能的影响及机理仍不清楚。因此开展如下研究：（1）比较具有致病性差异的不同糖基化位点AIV（野生型、158位缺失、169位缺失重组病毒；反向遗传技术构建）对小鼠/鸡DCs的感染能力；（2）比较各毒株对DCs天然免疫功能的影响，包括DCs吞噬能力、表型、活化、迁移、细胞因子表达、感染DCs刺激T细胞增殖与分化、感染DCs对呼吸道上皮细胞/巨噬细胞/T细胞的感染情况及细胞因子表达水平；（3）阐明唾液酸受体在各毒株诱导DCs天然免疫中的作用；（4）分析糖基化位点的改变对C型凝集素受体识别AIV能力的影响。本研究将为进一步阐明H5N1 AIV的致病机理奠定基础。

H5亚型禽流感病毒（AIV）可通过改变血凝素（HA）糖基化位点影响病毒对宿主的致病力及天然免疫水平。在AIV感染过程中，树突状细胞（DCs）是天然免疫调控的关键。然而HA糖基化位点的改变对DCs天然免疫功能的影响及机理仍不清楚。本研究首先应用qRT-PCR发现158位或169位糖基化位点缺失毒株（rS△158/rS△169）三株重组AIV可有限感染DCs；其次，与rS-WT相比，rS△158/rS△169显著促进DCs的表型标志、迁移标志的表达，显著促进促炎细胞因子的分泌；混合淋巴细胞反应实验发现，与rS-WT组相比，rS△158/rS△169组能够组显著促进CD4+T细胞的增殖；各毒株滴鼻感染小鼠后发现，与rS-WT相比，rS△158/rS△169可以显著促进DCs向鼻腔黏膜下迁移及颈淋巴结的迁移，其主要参与者为CD103+亚型。以上结果表明，与野生型毒株相比，158或169位糖基化位点缺失的H5N1亚型AIV能够显著增强DCs的天然免疫水平。应用唾液酸酶阻断DCs表面的α-2,3和α-2,6唾液酸受体后发现，各组AIVs NP表达量并未完全降低，表明AIVs并非完全依赖唾液酸受体途径入侵DCs；通过体外抑制剂阻断试验发现，rS△158/rS△169组的NP蛋白表达量显著下降；进一步发现，与rS-WT组相比， rS△158/rS△169病毒黏附细胞的能力增强，同时更易与SIGN-R1和MR两种C型凝集素形成共定位；体外中和抗体阻断试验发现，SIGN-R1和MR中和抗体可以阻断rS△158/rS△169组的NP蛋白表达量上调及表型标志CD80的表达，但MGL中和抗体阻断后NP蛋白及CD80的表达未受影响；体内小鼠滴鼻攻毒试验结果显示，与rS-WT组相比，rS△158/rS△169病毒能够募集高表达SIGN-R1和MR而非MGL受体的DCs迁移至鼻腔黏膜下。以上结果共同表明，与野生型病毒相比，158或169位糖基化位点缺失病毒，主要通过C型凝集素受体SIGN-R1和MR，而非MGL依赖途径入侵DCs，进而引起高水平的天然免疫应答。本研究为解析H5N1高致病性AIV对哺乳动物的致病机理提供一定的理论依据。