HA蛋白糖基化位点对H5N1亚型禽流感病毒致病性和抗原性的影响

Glycosylation of Haemoagglutinin (HA) protein of H5N1 subtype avian influenza virus (AIV) plays an important role in its evolution life, and results in immune escape and pathogenicity change. The result of sequence analysis shows that there are different combination patterns of glycosylation site on HA protein of H5N1 AIV. However, the selection mechanism of glycosylation sites for the viruses, and the effect of glycosyaltion site change on virulence and antigenicity remain unclear. The following experiments will be performed. First, we will analyse the glycosylation site patterns on HA protein of H5N1 AIV, select a clade 2.3.4 strain of H5N1 AIV as a wild-type strain, and construct a series of recombinant viruses with mutation of glycosylaton site in the global or stalk areas of HA protein by reverse genetic technique. Second, we will compare the mutants for the stability of passage, the binding characteristic of receptor, the ability of growth and replication, the sensitivity to temperature/pH/animal sera, and the ability for induction of apoptosis and necrosis. Third, we will compare the mutants for pathogenicity and transmission ability in different animals. Finally, we will compare the mutants for antigenicity variation and cross protection. This study will provide a prediction and alarm for H5N1 AIV due to the variation of antigenicity and virulence, and new information for vaccine design.

H5N1亚型禽流感病毒（AIV）血凝素（HA）蛋白的糖基化在病毒进化过程中起着重要的作用，可导致病毒的免疫逃逸及致病性变化。序列分析显示H5N1亚型AIV HA蛋白糖基化位点有不同的组合模式，而病毒对糖基化位点的选择机制、糖基化位点改变对病毒毒力及抗原性的影响还不清楚。本研究的主要内容包括:（1）分析H5N1亚型AIV HA蛋白糖基化位点及组合模式，选择2.3.4分枝的H5N1亚型AIV为母本，运用反向遗传技术构建HA蛋白头部及茎部区域糖基化位点突变的重组病毒；（2）比较重组病毒的传代稳定性、受体结合特性、生长复制能力、对温度/pH/动物血清敏感性、诱导细胞凋亡和坏死能力；（3）比较重组病毒对不同动物的致病性及传播能力的差异；（4）比较重组病毒的抗原差异性及诱导的交叉保护能力。研究结果将为H5亚型AIV由糖基化位点改变带来的抗原变异和毒力差异提供预测预警作用，为疫苗设计提供新的思路。

H5N1亚型禽流感病毒（AIV）在进化过程中很容易发生变异，其中很重要的一种方式就是表面蛋白-血凝素（HA）蛋白糖基化位点的数量和位置发生变化。为了探讨糖基化位点改变对病毒毒力和抗原性的影响，本项目以H5N1亚型AIV A/mallard/Huadong/S/2005为母本，构建了系列的糖基化位点缺失株，围绕缺失株的生物学特性、致病性、免疫原性及影响的可能机制开展了系统研究。（1）成功构建了HA蛋白头部糖基化位点突变病毒，证实HA蛋白158位糖基化位点的缺失是H5亚型AIV获得α-2,6唾液酸受体结合能力的前提。因此，H5N1 AIV可通过糖基化位点的改变使其获得α-2,6唾液酸受体结合特性，从而有利于病毒感染哺乳动物。（2）成功构建了HA蛋白茎部糖基化位点突变病毒，茎部11位糖基化位点的缺失HA蛋白的裂解能力下降，同时伴随23位或286位双缺失后，HA蛋白的裂解完全受阻。此外，茎部糖基化位点的缺失都可使流感病毒热稳定性和pH稳定性下降，尤其是11位糖基化位点的缺失。因此，茎部11位糖基化位点对病毒HA蛋白裂解和结构稳定起关键作用。（3）HA蛋白头部糖基化位点突变病毒对鸡仍为高致病性，与野生型的致病性一致，但单独去除H5亚型AIV HA蛋白158位或169位糖基化位点使病毒对小鼠的毒力显著增强；而HA蛋白茎部11位糖基化位点变突变病毒对鸡的致病性有所下降，而且对小鼠的致病性显著下降。（4）HA蛋白169位糖基化位点突变株免疫鸡可产生具有较好的交叉血凝抑制作用和交叉中和作用的抗体，也可对不同clade H5亚型 AIV攻毒后提供较好的交叉保护作用，具有广谱疫苗的特征。（5）初步证实了糖基化位点的变化会导致内质网应激，从而导致炎症因子上调，这可能是HA蛋白158位或169位糖基化位点突变株对哺乳动物致病性增强的原因之一。研究结果将为H5亚型AIV由糖基化位点改变带来的抗原变异和毒力差异提供预测预警作用，为疫苗设计提供新的思路。