146N糖基化位点对禽流感病毒神经氨酸酶活性的影响

Nueraminidase (NA),which is a kind of highly glycosylated membrane protein, plays the cruial role in the spliting up the sialic acid residues at the viral or host glycans terminals, and facilitating the viral spreading. Our previous indicated that there was only one particular highly conserved N-glycosylated site, N146(according the N2 subtype numbering), existed in all 11 subtype NA and located at the global center which near to the active site of enzyme catalysis. However,there are few researches involve in 146N. The aim of this project is to rescue a H9N2 subtype influenza strain with the removal of the 146N glycosylation site adopted by site-specific mutagenesis and reverse genetics. Detailed comparation of the viral glycan profiles would be take between two host systems, chicken embryos and human embryonic lung cell, according to the lectin microarray and mass spectrometry. This would reveal the implication from the loss of 146N glycosylation site to NA activities and viral glycan profiles. Our project would clarify the biological functions of 146N in NA and further developed the research of glycosylation in influenza virus.

神经氨酸酶（NA）是一种高度糖基化修饰的膜蛋白，通过水解病毒或细胞糖链末端的唾液酸残基，协助成熟病毒扩散。我们前期研究显示，在已知11种NA亚型中共同存在唯一一个高度保守的N-糖基化位点，即位于四聚体头部顶端中心且靠近酶活性中心的146N（按N2亚型编号）。由于在快速变异的NA头部中，这一高度保守的N-糖基化位点病毒生物学功能尚不清楚，四个146N位点形成的糖链簇对NA与不同拓扑结构唾液酸糖链的亲和力是否产生影响也缺乏研究。因此本课题拟通过定点突变与反向遗传学技术构建一株低致病性H9N2亚型禽流感病毒NA中146N位点敲除的毒株，借助凝集素芯片和生物质谱等糖组学技术，比较146N位点敲除前后病毒糖链谱的差异，分析该位点对NA酶活性及不同唾液酸亲和性的影响。本项目将扩展流感病毒糖基化修饰在NA中的研究，同时NA抗原位点的暴露可为未来抗流感疫苗研究提供新思路，因此具有重要理论意义和应用价值。

甲型流感病毒对人类社会造成了巨大的人员伤亡和财产损失。包括H1N1和H3N2人流感病毒、H7N9和H5N1高致病性禽流感病毒及2009 H1N1猪流感病毒等获得了大量的研究关注。进入宿主与子代扩散的关键环节涉及到了病毒表面膜蛋白血凝素与神经氨酸酶，而糖基化修饰则在其中起到了关键性的作用。因此本课题围绕流感病毒神经氨酸酶的极端保守的N-糖基化进行了深入研究。. 本课题组前期发现N146位于神经氨酸酶四聚体的正顶部，因此四个保守的N-糖基化位点的大分子量糖链影响了神经氨酸酶的活性中心-神经氨酸酶位点-脱离宿主环境，同时遮蔽神经氨酸酶的抗原位点抵抗宿主免疫系统。通过构建突变载体质粒与反向遗传学技术，我们培养出具有神经氨酸酶N146位点缺失毒株。比较该毒株突变前后在鸡胚增殖与人胚肺细胞增殖的增殖能力，发现其获得了较为稳定的繁殖能力。值得注意的是尽管该神经氨酸酶获得了较高的酶切活性，但是对于病毒来说增殖能力没有明显改变，并进一步发现出现了更加多样性的糖基化修饰。我们推测这是病毒对该位点缺失做出的一种补偿机制。. 通过对近3万株甲型流感病毒的基因组片段进行序列比对和全亚型的进化分析，我们理清了甲型流感病毒八条基因片段的进化关系，并指出部分涉及抗药性的氨基酸突变（如神经氨酸酶中的H274Y）实际只是出于不同进化分支中的同一位置的氨基酸。正是由于流感病毒中存在着复杂的重组突变，从而促进了流感病毒在与宿主相互作用下获得了长期生存能力。. 基于申请课题，本研究从糖生物学角度深入挖掘N148糖基化位点在流感病毒神经氨酸酶中的功能，这将有助于针对糖基化影响病毒宿主特异性的。我们从全亚型甲型流感病毒进化的宽度提供了流感病毒各基因片段的进化与变异，这为揭示当下各种流感病毒的起源与进化，以及病毒抗药性提供充足的理论基础，为进一步进行抗流感抑制剂研究奠定研究基础。