空肠弯曲菌适配体探针筛选及检测新方法研究

Campylobacter jejuni (CJ)is one kind of important phthogen, which is realted to 90 percent of the occurrence of acute bacterial enteritis. The clinic infection of CJ is almost the same as that of salmonella and shigella. Under the unfavorable conditions, CJ could go into the stage of viable but non-culturable (VBNC), which still maintains the properties of toxicity and pahtogenicity. However, most of the culture based traditional methods could not determine the CJ at the stage of VBNC effectively. In this project, we will develop the new rapid and sensitive detection method of CJ based on the fluorescent resonance energy transfer (FRET) of up conversion nanoparticles (UCPs). Firstly, the rapid screening platform for aptamer against CJ would be constructed; And then, the sencondary structure and binding constant of the aptamer would be determined intensively, which would supply the effective basis for the development of different aptamer-based methods. Following, the aptamer would be modified on the surface of UCPs to get the fluoresenct probes.The sensitivity and the selectivity of the FRET-based CJ detection mthod will be studied carefully. More importantly, the new principle of FRET of UCPs will be put forward for CJ detections. Finally, the detection results of CJ by the new developed method will be confirmed with the classical instrumental based methods. All achievements of this project will provide a novel and effective tool for target bacterial detections and guarantee the bacterium-related food safety issues.

空肠弯曲菌是一种重要的食源性致病菌，约90%的急性细菌肠炎与该菌相关，临床感染率不亚于沙门菌和志贺菌。环境条件不利时该菌可进入"活的非可培养状态"（VBNC），仍具较强的致病性，但普遍使用的常规检测方法对VBNC状态下的空肠弯曲菌检出率极低。本项目拟采用核酸适配体结合上转荧光纳米粒子的荧光共振能量转移技术，建立空肠弯曲菌快速、灵敏的检测新方法。首先，利用功能性纳米材料建立空弯菌适配体探针快速筛选平台；其次，对所筛选的空肠弯曲菌核酸适配体探针二级结构和亲和常数进行系统研究，并对所建立的基于核酸适配体探针的空肠弯曲菌快速检测方法的灵敏度、特异性及稳定性进行测试；同时，发展基于上转换荧光纳米材料的荧光共振能量转移进行目标致病菌快速检测新原理。利用培养法和PCR等传统方法对所建立快速检测新方法进行比对，并利用所建立空肠弯曲菌快速检测方法对实际样品进行检测，从而为食源性致病菌检测提供有力技术支撑。

空肠弯曲菌是一种重要的食源性致病菌，约90%的急性细菌肠炎与该菌相关，临床感染率不亚于沙门菌和志贺菌。环境条件不利时该菌可进入“活的非可培养状态”（VBNC），仍具较强的致病性，但普遍使用的常规检测方法对VBNC 状态下的空肠弯曲菌检出率极低。本研究通过基于整菌的指数富集的配基系统进化技术筛选出具有高特异性的空肠弯曲菌单链核酸适配体。经过12轮筛选，寡核苷酸库被富集，最终筛选出最优序列，它具有高度特异性，亲和常数Kd值为1.366+0.278 nM，低于其他序列。利用所筛选出适配体建立平板比色法检测空肠弯曲菌：在最优条件下，检测浓度在13−1.3⨉106cfu/mL (R2=0.995)具有良好线性，并且LOD可达到10 cfu/mL。研究还建立了利用上转换荧光材料检测空肠弯曲菌的检测方法：将上转换荧光材料-核酸适配体探针复合物和金纳米粒子-互补探针复合物混合，在酶标仪中检测荧光信号，建立空肠弯曲菌浓度与荧光强度之间的关系。LOD可达到10 cfu/mL。并用培养法等传统方法对所建立快速检测新方法进行比对，结果认定该方法良好适用于猪肉等食品基质（实际样品）中空肠弯曲菌的检测，满足相关标准要求，符合口岸食品检验中“检得出、检得快、检得准”的需求。本研究在课题组前期建立的适合我国的食品中空肠弯曲菌检验的综合技术体系（包括快速筛检与确证方法）的基础上进行完善，将所建立的空肠弯曲菌检测体系应用到主要食品（如禽肉、猪肉、牛奶等）以及部分宿主动物的流行病学资料的检测：共分离到弯曲菌属菌株652株，其中空肠弯曲菌为350株，并在此基础上建立了国内菌株数量第一的不同宿主来源的空肠弯曲菌野生菌株资源库。项目研究期间，共发表SCI论文4篇；获授权中国发明专利2项；制定并颁布国家及检验检疫行业标准3项；获省部级科技进步一等奖、三等奖各1项；联合培养硕士生1名、硕博连读生1名、获国家级人才计划“万人计划青年拔尖人才”1名。该项目研究为我国空肠弯曲菌的检验和开展食源性疾病的溯源提供了充足的菌株资源，为今后的国际食品贸易活动中，我国对于进出口食品的安全检验、沟通谈判以及解决贸易争端的提供了重要技术依据，具有重要的社会经济效益和广阔的应用前景。