基于宏转录组学的窖池微生物共酵生香的分子机理研究

The quality of strong-flavor liquor depends on the flavor components produced by co-fermentation of mixed microorganisms in pit mud and Zaopei, which is a key problem for the production of strong-flavor liquor. In the project, process of the flavor formation by the co-fermentation of mixed microorganism are investigated using metatranscriptomic and high-throughput 16S rRNA/ITS sequencing. Firstly, the microbial community structure and dynamics, and the active microbial groups are analyzed to clarify the interaction between microorganisms in pit mud and Zaopei. Secondly, comparative analysis of expression difference and gene transcription of microorganisms in Zaopei during the different stages of fermentation is performed in combination with microbial community succession and metabolic intermediates from Zaopei, to elucidate microbial populations metabolic pathways, key enzymes and functional genes involved the formation of main flavoring substances such as ethyl hexanoate for Chinese strong-flavor liquor. Furthermore, the metabolic network of microorganisms responsible for the flavor formation is constructed to reveal the molecular mechanism of the flavor formation by co-fermentation of mixed microorganisms during solid-state fermentation, which will lay the theoretical foundation for optimizing the conventional solid-state fermentation process and improving the efficiency of biotransformation. In addition, these studies will provide new perspectives on development and application of microbial resources and functional genes in cellar.

本项目针对浓香型白酒生产中窖泥与糟醅微生物共酵生香这一关键问题,首先通过开展16S rRNA/ITS的高通量测序及数据分析，深入了解发酵过程中微生物的群落结构与动态变化；进一步通过宏转录组学方法，系统分析不同发酵阶段糟醅中微生物的基因转录与表达差异，同时结合微生物群落演替与代谢中间产物变化的分析，重点阐明参与己酸乙酯等主要香味物质形成的微生物种群，代谢途径,以及关键酶基因。在此基础上，构建窖池微生物共酵产香的代谢调控网络，从分子水平上揭示窖池固态发酵生香的微生态学机制，为优化白酒传统发酵工艺，提高生物转化效率提供理论依据。此外，该项目还将为深入发掘窖池微生物资源及功能基因，实现工业化生产提供新的思路。

浓香型白酒的发酵是通过多种微生物在一个特有的窖池中完成的，但对于其复杂的微生物机制仍缺乏系统的认识。本项目通过高通量测序（MiSeq和HiSeq）技术，系统研究了浓香型白酒发酵过程中微生物群落组成与动态变化，基因组成与功能，以及相应的代谢产物变化。结果表明，发酵可划分为三个阶段：（1）糖化期（1-23天），淀粉等大分子物质被转化为葡萄糖，微生物群落主要由细菌、古菌和真菌组成。其中原核生物多样性呈显著下降趋势，而真核生物多样性则明显增加；（2）产酸期（23-48天），葡萄糖被转化为有机酸和醇类，乳酸和乙醇浓度显著增加。乳酸菌成为最优势的微生物类群，而优势真菌主要为热子囊菌，翘孢霉和曲霉菌；（3）产酯期（48-70 天）,开始产生乙酯类风味物质（如乳酸乙酯、乙酸乙酯和己酸乙酯），微生物群落则相对稳定与中期变化差异不大。典型对应分析 (CCA) 显示酵母、红曲霉和根霉则与葡萄糖浓度显著正相关，而乳酸菌、芽孢菌、孢盘菌、根霉菌及未分类的腔菌目和煤炱目与有机酸和酯类风味物质显著正相关。.宏基因组分析进一步表明，在发酵中后期（23-70天），微生物群落主要由细菌组成，最优势的类群是厚壁门的乳酸菌属（丰度>70%）。不同发酵阶段存在显著差异的物种（Biomarker）, 可用于发酵阶段的特征检测。功能基因注释分析显示，在发酵过程中代谢类的基因数目最多，其次是环境信息过程响应、遗传信息处理和细胞加工的基因数目，而与人类疾病相关的基因数量相对较少。其中，代谢相关的高丰度基因主要包括参与淀粉、蔗糖代谢、糖酵解及丙酮酸等代谢途径的关键基因。.本项目全面解析了窖池发酵过程中的微生物组成及其动态演替，以及微生物与风味物质之间的相关性，有助于理解窖池微生物的发酵生香机制。此外，我们还首次发现了窖池微生物利用乳酸合成己酸的代谢模式，该发现是对窖池生香理论的重要突破。