基于宏基因组与转录组学的窖泥微生物群落结构与功能研究

The quality of Luzhou-Flavor Liquor depends on the microbial community in the fermentation pit. Good wine can only be produced in aged pits, which is precisely because of a unique micro-ecosystem formed gradually in long-term process of brewing wine by solid-state fermentation for producing organic acids. However, the functioning mechanism of its microbial community on the whole still remain uncertain. In the project, the studies of microbial community structure, genomic compositions and transcription levels in new pit mud (5 years) and aged pit mud (100 years) in Jiannanchun Winery are carried out by coupling metqagenomic and metatranscriptomic approach, respectively, for elucidating the metabolic pathways and regulation pattern of key microorganisms involved in organic acid (eg. caproic acid) production within fermentation pit mud . Moreover, comparative analysis of metqagenomic and metatranscriptomic data from a new pit and an aged pit will be performed in combination with important metabolic intermediates from pit mud, which can reveal the reasons for the significant differences of their function on community and gene level, laying the foundation for the optimization of conventional solid-state fermentation process and improving the efficiency of biotransformation. .The project, firstly integrating metqagenomic and metatranscriptomic approach to study micro-ecosystem in the pit mud, will contribute to an overall understanding of microbial community structure and function in the pit mud and also provide new perspective on development and application of microbial functional genes and enzyme resources.

浓香型曲酒的优劣，取决于酒窖中的微生物群落。所谓"老窖出好酒"，正是由于酒窖在长期固态发酵酿酒过程中逐渐形成了独特的微生态系统，其主要功能之一就是有机酸代谢。然而目前其群落的整体作用机制尚不清楚。该项目拟以剑南春酒厂的窖泥为研究对象，综合宏基因组与转录组学方法，系统分析老窖泥（100年）与新窖泥（5年）的微生物群落结构、基因组成份及转录丰度，阐明窖泥中参与有机酸（如己酸）代谢的重要的微生物类群及其代谢途径与调控模式。通过新、老窖泥的宏基因组与转录组数据的比较，同时结合其代谢中间产物分析，从群落与基因水平揭示造成二者功能差异的微生态学机制，为从根本上优化传统固态发酵工艺和提高生物转化效率奠定基础。.该项目首次综合利用宏基因组与转录组学方法研究窖泥微生态系统，既有助于全面认识窖泥微生物的群落结构和功能，同时也可为开发利用窖泥功能菌及其基因与酶资源提供新的思路。

中国浓香型白酒占中国白酒市场份额约70%。窖泥微生物在浓香白酒发酵中起重要作用。但是，对于窖泥微生物的群落结构及其随窖龄的变化，以及微生物的基因功能与潜力尚不清楚。该项目主要利用第二代高通量测序技术对传统固态发酵池的窖泥微生物群落结构、生物多样性及宏基因组和转录组进行了系统研究。结果表明，窖泥微生物群落主要由细菌和古菌组成，细菌丰度显著高于古菌；窖泥微生物主要分布在19个细菌门和2古菌门，最优势的分别为厚壁菌门（Firmicutes）66.8%、拟杆菌门（Bacteroidetes）16.0%和广古菌门（Euryarchaeota）9.0%；基于微生物群落结构的演替，窖泥老熟为可划分三个阶段：第一阶段（1-10年）为驯化期，第二阶段（10-25年）为过渡期，第三阶段（>25年）为成熟期。窖泥微生物群落与窖泥化学特性有显著的相关性。 宏基因组结果显示，窖泥微生物群落中最优势的门分别为Firmicutes（48.0%）, Euryarchaeota（19.0%）, Bacteroidetes（13.5%）, Actinobacteria（2.5%） and Proteobacteria（2.1%）；糖类代谢是窖泥微生物中最旺盛的生化代谢，包括混合酸发酵与乙酰辅酶A（Acetyl-CoA）的转化。功能基因分析表明，窖泥微生物可通过乙醇和乳酸两种底物合成浓香型白酒的主要香味物质前体-己酸，而丁酸也可通过Acetyl-CoA途径和赖氨酸（Lysine）两种途径合成。其中，生成丁酸的末端酶Buk编码基因，体现出新老窖泥间的极显著差异（p<0.01），该基因与关键风味物质己酸乙酯和己酸的含量呈高度相关（P<0.05）。宏转录组分析显示窖泥中存在高丰度未知功能的基因，表明存在大量未培养的活性微生物；老窖泥中厚壁门类微生物丰度明显增加，而广古菌门和拟杆菌门明显下降；二者在多条代谢途径中存在显著的基因转录差异。以上研究结果从分子水平阐明了我国传统酿酒工艺中的微生物代谢途径与调控模式，为“老窖产好酒”的实践经验提供了理论依据。