线粒体基因原发突变和继发突变相互作用导致Leber遗传性视神经病变的致病机理研究

Leber’s hereditary optic neuropathy (LHON) is the rare maternally inherited eye diseases.Three primary mtDNA mutations (11778G>A, 3460G>A and 14484T>C) are the molecular bases of this disorder. However, mitochondrial modifiers are proposed to modify the phenotypic expression of primary LHON-associated mtDNA mutations. In this study, we investigated the pathophysiology of secondary m.14502T>C mutation in the LHON expression by taking advantage of a large cohort of 1218 Chinese probands with LHON. We performed functional assays by using the cybrid cell model to understand the pathophysiology of LHON that were manifested by interaction between primary and secondary mtDNA mutations. Moreover, we established fibroblast cultures from skin, these human somatic cells will be reprogrammed directly to pluripotency by ectopic expression of four transcription factors to yield induced pluripotent stem (iPS) cells, then, the iPSCs will be differentitation into retinal ganglioncells(RGCs). Our study will elucidate the role of mtDNA mutations in the induction and differentiation of RGCs, and provide direct evidence for RGCs impaired by the mtDNA mutation. These findings will provide new insights into the pathophysiology of LHON, the cybrid cell mode and iPS technology will also improve the molecular diagnosis of LHON to new heights.

Leber遗传性视神经病变（Leber's Hereditary Optic Neuropathy，LHON）是一种罕见的母系遗传致盲性眼病。三个线粒体基因（mtDNA）原发突变（11778G>A，3460G>A和14484T>C）是发病的主要分子基础，修饰因素在LHON家系表型表达中起着重要作用。本研究拟在前期工作基础上，对携带m.14502T>C继发位点的家系分析，利用转线粒体细胞模型从生化水平阐明m.14502T>C与原发突变m.14484T>C协同作用导致LHON的发病机制；建立携带mtDNA突变的iPS细胞模型，并定向分化为视网膜神经节细胞（RGCs），阐明mtDNA突变在iPSCs的诱导及定向分化中的作用，为mtDNA突变对RGCs功能的影响提供直接证据。本课题将为LHON发病机制的研究提供新视角，采用的转线粒体细胞模型和iPS技术也将LHON的检验诊断方法提高到新的高度。

Leber遗传性视神经病变（Leber's Hereditary Optic Neuropathy，LHON）是一种罕见的母系遗传致盲性眼病。三个线粒体基因（mtDNA）原发突变（11778G>A，3460G>A和14484T>C）是发病的主要分子基础，修饰因素在LHON家系表型表达中起着重要作用。本研究在前期工作基础上，对携带m.14502T>C继发位点的家系进行了详细的临床和分子遗传学分析，发现携带双突变的家系的外显率和表现度都要明显高于单独携带m.14484T>C突变或单独携带 m.14502T>C突变的家系。通过构建转线粒体细胞模型，从生化水平阐明m.14502T>C与原发突变m.14484T>C协同作用导致LHON的发病机制，通过研究线粒体基因编码蛋白、复合体I组装、ATP的产生和膜电势电位的改变、氧耗量的改变以及活性氧等生化功能我们发现，携带双突变的细胞株其编码的蛋白含量明显降低、复合体I组装功能下降、细胞自噬和凋亡增加，ATP合成和膜电位显著降低，ROS产生增加，说明结果都足以说明m.14502T>C是与LHON相关的继发性突变位点，并且能够增加原发性突变m.14484T>C的表型表达。此外，我们用三个先证者及对照者的外周血建立永生化淋巴细胞系，用4种转录因子的逆转录病毒感染，建立携带mtDNA突变的iPS细胞模型，并筛选出单克隆培养，通过碱性磷酸酶染色，干细胞标志基因的鉴定，及畸胎瘤的形成等多方面完成特异性iPSCs模型的鉴定，初步进行了RGCs的定向诱导分化。本课题为LHON发病机制的研究提供新视角，采用的转线粒体细胞模型和iPS技术也将LHON的检验诊断方法提高到新的高度。