PRICKLE3与线粒体11778G>A突变互作导致Leber遗传性视神经病变的分子机制研究

Leber’s hereditary optic neuropathy (LHON) is the most common mitochondrial disorder.The primary pathological feature of LHON is the specificity loss of retinal ganglion cells. The primary etiological factor of LHON is mitochondrial genome mutations. However, nuclear modifier gene act as a synergy trigger in the modulating phenotype of LHON. In our previous work, by applying whole-exome sequencing, we found an X-linked gene PRICKLE3 as a susceptibility allele for LHON associated with m.11778G>A. The aim of this present study is to elucidate the pathophysiology of LHON arising from the synergy between X-linked nuclear modifier gene PRICKLE3 and mtDNA mutation m.11778G>A. Firstly,It is critical to construct nerve cell model to further investigate the pathophysiology of LHON associated with MT-ND4 mutation. by using nerve cells and iPSCs derived from patients. Firstly, induced pluripotent stem cell (iPSCs) derived from family members carrying either with PRICKLE3 c.157C>T mutation or m.11778G>A mutation or both mutations will be differentiation into retinal ganglion cells. Secondly, in order to clarify the tissue specificity of LHON, studies will be carried out to assess the effects of the synergy between m.11778G>A mutation and PRICKLE3 mutation on the function of retinal ganglion cells. Thirdly, to explore the restorational strategy of retinal ganglion cells, the mutation of PRICKLE3 will be corrected using CRISPR/Cas9 technique . The implementation of this research, will contribute to a more comprehensive interpretation for LHON pathogenesis, and provide new angle for LHON treatment, and technique surpport.

Leber遗传性视神经病变（LHON）是一种母系遗传性视神经眼病，视网膜神经节细胞的特异性减少是LHON的主要病理特征。线粒体DNA突变是导致LHON的重要分子基础，核修饰基因在LHON表型的表达中具有协同作用。前期工作中，申请人发现LHON的新修饰基因PRICKLE3，本项目拟在此工作基础上深入研究PRICKLE3以及m.11778G>A突变互作导致LHON的分子机制。首先，将携带PRICKLE3及m.11778G>A的iPSCs定向分化为视网膜神经节细胞；其次，评估PRICKLE3与m.11778G>A突变互作对视网膜神经节细胞功能的影响，诠释上述突变相关LHON组织特异性发病的机理；最后利用CRISPR/Cas9技术矫正PRICKLE3，探讨视网膜神经节细胞功能缺陷的修复策略。本项目的实施将进一步完善LHON的致病机制，为LHON的治疗提供新思路和技术支持。

Leber遗传性视神经病变（Leber's Hereditary Optic Neuropathy，LHON）是一种导致视神经病变的母系遗传性眼病,主要累及视网膜和巩膜筛板前部视乳头黄斑束纤维。LHON的致病机制虽然一直在不断的完善，但仍存在两个问题亟待解决：1）携带相同线粒体DNA突变的不同家系，外显率却差异巨大；2）LHON患者仅表现出视网膜神经节细胞特异性的减少。本项目针对上述问题，从核基因与线粒体基因组突变互作的新角度，利用iPSCs定向分化为视网膜神经节细胞，探索了LHON不完全外显以及组织特异性致病的分子机制。首先，本项目成功建立了LHON疾病特异iPSCs定向诱导为视网膜神经节细胞的技术体系。其次，本项目研究了核修饰基因PRICKLE3与线粒体m.11778G>A突变在诱导分化为RGC过程中对分化效率的影响，发现m.11778G>A突变会降低其在分化为RGC过程的效率，同时携带PRICKLE3和m.11778G>A突变的细胞诱导分化为RGC的过程中效率极其低下。然后，对iPSCs诱导的RGC的形态和功能进行研究，发现同时携带PRICKLE3突变和m.11778G>A突变细胞诱导的RGC形态异常，且神经突延伸能力减弱，电生理功能减弱。最后我们发现，同时携带PRICKLE3突变和m.11778G>A突变细胞诱导的RGC线粒体功能降低，更易诱发凋亡。同时利用PRICKLE3敲低的细胞模型对PRICKLE3的功能进行研究，发现，PRICKLE3敲低后导致氧耗降低，线粒体ATP合成减少，免疫共沉淀显示PRICKLE3与线粒体复合体V相互作用，PRICKLE3敲低导致线粒体复合V上的蛋白亚基表达降低、线粒体复合体V胶内酶活力降低、完整组装的线粒体复合体V单体减少，说明其可能影响线粒体复合体V的组装，从而导致线粒体的功能障碍、线粒体形态异常。而凋亡水平并未显著的升高，提示PRICKLE3突变所导致的影响具有组织特异性，仅在特定的RGC细胞中会加剧凋亡的增加，从而影响LHON的表型表达。本研究的开展从核基因和线粒体基因的角度阐释了LHON外显不全的特点，并利用iPSC技术，将患者来源的细胞诱导为组织特异性的RGC细胞，阐释了LHON组织特异性发病的分子机制，为LHON的治疗奠定了分子基础。