蜂毒素对骨肉瘤细胞VHL/HIF信号转导通路的影响

骨肉瘤是高度恶性骨肿瘤，极易转移。研究证实其易转移与瘤内血管新生密度密切相关，实体肿瘤的高速生长必然会导致肿瘤内部血液供应的相对不足和氧张力的降低，肿瘤缺氧细胞的存在不仅使肿瘤对放化疗的抗拒性增强，而且使肿瘤细胞侵袭性表型表达上升从而导致肿瘤的转移。在缺氧诱导肿瘤基因表达的信息通路上，VHL/HIF起着中枢纽带作用，它能够诱导多种血管生成相关因子的转录活性增强，在肿瘤新血管生成、增殖和转移中起重要作用。我们前期研究表明蜂毒素能抑制ECV304 细胞及鸡胚绒毛尿囊膜血管生成，降低骨肉瘤中的血管生成密度，并证实与降低VEGF及bFGF等的表达有关，但对蜂毒素抑制血管生成机制的进一步研究尚未展开。因此本课题拟采用细胞和分子生物学等方法，通过体内外实验首先探讨蜂毒素是否通过阻断VHL/HIF途径而发挥抑制骨肉瘤血管生成作用，进一步研究蜂毒素抑制骨肉瘤血管生成的机理，为蜂毒素的临床应用提供理论依据。

本课题原计划的实验均已完成。采用MTT法观察了蜂毒素对常氧和缺氧情况下培养的骨肉瘤细胞的生长抑制作用，发现蜂毒素能够明显抑制骨肉瘤细胞的增殖，并在一定的浓度范围内存在着明显的剂量依赖关系。蜂毒素在缺氧情况下对骨肉瘤细胞的作用更强。蜂毒素对荷瘤裸鼠瘤体生长具有明显的抑制作用，能降低瘤体内CD31及HIF-1α的表达。通过Western Blot方法观察了蜂毒素体内、外对VHL、HIF-1α及其下游的VEGF、Enolase 1、Aldolase A蛋白的表达情况，发现蜂毒素能够不同程度地抑制HIF-1α及其下游的VEGF、Enolase 1、Aldolase A蛋白的表达，但对VHL蛋白的影响不大。通过Realtime PCR方法观察了蜂毒素体内、外对VHL、HIF-1α及其下游的VEGF、Enolase 1、Aldolase A基因的表达情况，发现蜂毒素能够不同程度地抑制VEGF、Enolase 1、Aldolase A基因的表达，但对HIF-1α、VHL基因的影响不大。除原计划实验外，我们初步观察了蜂毒素对荷瘤鼠肺转移的影响，发现蜂毒素能够抑制骨肉瘤的肺转移。采用划痕及transwell小室实验观察了蜂毒素的抗迁移能力，发现蜂毒素能够抑制骨肉瘤的迁移。我们得到的结论是：蜂毒素可以抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移，机制可能与其能阻断HIF-1α蛋白表达从而下调其下游的VEGF、Aldolase A及Enolase 1蛋白表达，进一步促进肿瘤的血管生成及肿瘤细胞的糖酵解有关，为蜂毒素的临床应用提供了一定的实验依据。蜂毒素并未影响VHL蛋白及基因的表达变化，蜂毒素通过哪条上游通路阻断HIF-1α蛋白表达需要我们进一步探索和研究。该发现为进一步研究蜂毒素抗骨肿瘤机理提供了实验基础。