补虚活血逐瘀法对肝纤维化发生中信号传导网络的调控机制研究

肝纤维化是多种慢性肝病的共同病理变化，然而其发生机制至今尚未阐明，治疗上也缺乏针对性措施。大量的临床实践证实，补虚活血逐瘀法（中医经典代表方大黄蟅虫丸）防治肝纤维化疗效确切，但是作用机制不清楚。本项目拟在前期的研究基础上，采用HE染色法进行肝组织病理学检查，利用放免法检测肝纤四项，应用LiquiChip蛋白液相芯片系统检测肝纤维化相关因子表达谱，应用双向电泳、质谱仪等蛋白组学相关技术和方法，筛选差异磷酸化蛋白表达谱，然后利用免疫组化、Western Blot等方法鉴定关键蛋白质，应用生物信息学分析肝纤维化发生的有关因子与细胞信号分子（磷酸化蛋白）的内在联系，以弄清肝纤维化发生过程中的信号传导网络，为提供针对性的防治措施奠定理论基础。通过利用大黄蟅虫丸干预研究，明确补虚活血逐瘀法防治肝纤维化的作用靶标及调控机理，为其临床应用提供理论依据。这对于肝纤维化的防治具有重要意义。

目标：观察补虚活血逐瘀法（大黄蟅虫丸）对肝纤维化大鼠模型肝纤维化程度的影响；分析大黄蟅虫丸对肝纤维化血清指标的影响；检测大黄蟅虫丸对对肝纤维化大鼠细胞因子GM-CSF、IL-13、IL-18、IFN-γ和瘦素表达的影响；研究大黄蟅虫丸对丝裂原活化蛋白激酶通路和核因子-κB通路的影响，探讨丝裂原活化蛋白激酶及NF-κB调节细胞因子表达的可能机制。.方法：对肝组织进行病理学检查，HE染色观察其肝纤维化程度；应用放免法检测肝纤维化四项指标，透明质酸酶（Hyaluronidase, HA），层粘连蛋白（Laminin, LN），IV型胶原（Collagen Type IV, IV－C），III型前胶原（Procollagen III, PC III）；应用蛋白质液相芯片技术检测细胞因子GM-CSF、IFN-γ、IL-13、IL-18和瘦素水平；应用蛋白免疫印记分析上述药物对丝裂原激活的蛋白激酶的表达及磷酸化水平的影响；应用凝胶迁移率变动实验研究上述药物对NF-κB活化入核的影响，以综合分析大黄蟅虫丸防治肝纤维化的作用通路及调控机理。对实验数据采用SPSS 13.0软件包进行统计分析。.结果：补虚活血逐瘀法（大黄蟅虫丸）能够减少炎细胞浸润、胶原纤维增生和肝细胞脂肪变性，改善肝小叶结构从而减轻肝纤维化的发生；大黄蟅虫丸能降低肝纤维化大鼠的HA、LN、IV-C和 PC III水平，其中尤以HA 和IV-C明显，提示即使剔除炎症因素的影响，大黄蟅虫丸仍表现出良好的降低血清肝纤维化指标的治疗效果；大黄蟅虫丸能降低GM-CSF、IL-13、IL-18和瘦素表达，增加IFN-γ表达，提示可能是通过抑制炎症形成、抑制成纤维细胞增殖并抑制胶原沉积而干预肝纤维化；大黄蟅虫丸能降低磷酸化p38和磷酸化JNK的表达，一方面能直接降低胶原基因的转录，降低其合成水平，同时能增加HSC凋亡；另一方面p38和JNK磷酸化水平的降低，可能通过降低NF-κB活化入核，调节炎症因子表达，从而达到防治肝纤维化的作用；大黄蟅虫丸降低NF-κB活化入核，一方面可能通过降低GM-CSF、IL-13、IL-18转录，增加IFN-γ转录，减轻肝内炎症因子的表达，降低四氯化碳引起的炎症变化；另一方面，NF-κB活化入核减少，减少JNK磷酸化，增加HSC凋亡，从而达到减少成纤维细胞的增殖并减少胶原的合成的作用，减少肝纤维化