兰科菌根真菌定殖分子机制研究

Cymbidium belongs to Orchidaceae and has important ornamental value. In nature, most orchid species are dependent on mycorrhizal fungi for seed germination and growth during seedling stage even grown stage of some orchid species. Tulasnella sp. is the most common mycorrhizal partner of orchids. These fungi are distributed world-wide and normally found in every ecosystem, from tropical to temperate climate zones. In this paper, the orchid mycorrhizal fungi will be separated and identified. Symbiosis system will be constructed using the plantlets of Cymbidium sp. co-cultivated with Tulasnella sp. Transcriptome and proteomics will be used to comprehensive understanding the genes expression of the fungi-plant symbiont. The key genes of Tulasnella sp. will be screened by bioinformatic methods, and the genes encoding the transcription factor, carbohydrate enzymes, secretion proteins, transporter protein related genes will be concerned especially. The function of these genes will be analyzed by using the method of subcellular localization, yeast two hybridization and mutation/complementation assay. These results will reveal the genes function in the process of colonization of fungi and illustrate the molecular mechanism of colonization of fungi. The results of this study will lay a foundation for interpretation the symbiotic molecular mechanism between orchid plants and mycorrhizal fungi, and provide a reference for orchid plant conservation and propagation.

中国兰属（Cymbidium）植物是兰科植物中最具观赏价值的类群之一。兰科植物和真菌形成典型的兰科菌根，菌根共生关系伴随着兰科植物从种子萌发到开花结果的全部生活史。胶膜属（Tulasnella）真菌是一类世界范围内广泛分布且最具研究价值的兰科菌根真菌。本研究以胶膜菌属真菌和兰属植物为主要研究对象，分离具有促进兰属植物幼苗生长作用的菌根真菌，并构建真菌与兰属植物幼苗的共生体系，利用转录组和蛋白组联合分析共生体基因表达信息，同时利用生物信息学方法筛选与真菌定殖相关关键基因，重点关注转录因子、碳水化合物酶、转运蛋白、分泌蛋白等相关编码基因，并通过亚细胞定位、酵母双杂交技术和突变/互补分析等方法对候选基因功能进行研究，明确基因在定殖过程中的作用，解析真菌定殖的分子机制。为进一步揭示菌根真菌与兰科植物相互作用机理奠定基础，同时为菌根真菌应用于兰科植物保育和高效繁殖工作提供参考。

菌根真菌在兰科植物生活史中具有重要作用。自然状态下的兰科植物必须从菌根真菌中获得营养才能正常生长。本研究以兰科植物菌根真菌为研究对象，将所分离获得兰科菌根真菌分别与兰属（Cymbidium）、树兰属（Epidendrum）和石斛属（Dendrobium）植物进行共培养，筛选获得了多株可有效促进兰科植物种子萌发和原球茎生长的菌根真菌以及最适培养条件，明确了不同兰花菌根真菌与兰科植物兼容性不同，并且兰科植物在生长发育的不同阶段最适菌根真菌不同，且菌根真菌与兰科植物之间的兼容性受到外界环境的影响。在此基础上，挖掘获得了一株在一定条件下可促进红花树兰（Epidendrum radicans）生长但对硬叶兰（Cymbidium mannii）致死的菌株Cej3。细胞核染色结果表明，菌株Cej3每个细胞均具有两个细胞核。本研究对菌株Cej3进行了全基因组测序，组装获得110.9Mb 的基因组结果；共获得667条contig，平均长度为166,427 bp， contig N50为429,264bp；共获得373个scaffolds，scaffolds平均长度为266,755bp，scaffold N50为624kb；共预测获得25,982个编码基因，其中包括2,894个碳水化合物酶相关基因，以及5,351个效应子蛋白编码基因；组装获得一个长度为172,757 bp的双链环形线粒体基因组。通过多基因串联分析、构建线粒体基因组核心基因与全基因组直系同源基因系统进化树明确其分类地位，基于比较基因组学方法推算兰科菌根真菌分化时间以及预测碳水化合物酶相关基因家族情况，并利用转录组测序筛选获得了50个碳水化合物酶和效应子编码基因等与定殖相关基因；通过实时荧光定量PCR明确了糖基水解酶家族GH7、GH15和GH28成员编码基因在共生关系建立过程中的表达情况，推测上述基因在菌根真菌定殖兰科植物过程中具有重要作用，菌根真菌在植物组织中的定殖在很大程度上受到宿主植物本身营养需求和生理状态的调节。本研究探讨了在共生过程中兰科菌根真菌与植物防御系统之间建立平衡的分子机制，为菌根真菌应用于兰科植物保育和高效繁殖工作等提供参考以及为提高石斛属植物药用品质提供理论基础。