Nr5a2/SALL4维持胃癌干细胞自我更新能力的分子机制研究

Self-renewal of gastric cancer stem cells (GCSCs) was recently recognized as a driving force of malignant growth in gastric cancer. We found that SALL4+ gastric cancer cells possessed self-renewing capacity, and transcription factor Nr5a2 was a key regulator. However, the underlying mechanism of action of Nr5a2/SALL4 in self-renewal of GCSCs is to be investigated. Based on the reports and preliminary data, we hypothesize that Nr5a2 maintained self-renewal of SALL4+ GCSCs by upregulating SALL4 expression at transcriptional level. We plan to explore the transcriptional regulation effecte of Nr5a2 on SALL4 by using chromatin immunoprecipitation (ChIP), electromobility shift assay (EMSA), luciferase reporter assay and DNase I footprinting assay. The roles of Nr5a2 and SALL4 in self-renewal were investigated by a overexpression and a conditional shRNA expression lentiviral system. We plan to analyze the follow-up data and clinical samples of gastric patient, and explore the value of Nr5a2/SALL4 expression status in gastric cancer prognosis assessment. This project may shed light on the molecular and cellular mechanisms of malignant growth in gastric cancer and provide novel target for inhibiting self-renewal of GCSCs.

胃癌干细胞(GCSCs)的自我更新能力是胃癌恶性生长的源动力，我们发现SALL4+胃癌细胞具有GCSCs的自我更新特性，且转录因子Nr5a2是维持其自我更新的关键基因，但Nr5a2/SALL4发挥作用的具体分子机制不详。结合文献报道和初步实验结果，本项目提出：Nr5a2可能通过转录激活SALL4表达，维持SALL4+ GCSCs的自我更新。项目拟采用CHIP、EMSA、DNaseI足迹分析、萤光素酶报告基因实验探讨Nr5a2调控SALL4表达的分子机制；构建过表达和可诱导调控shRNA载体，体内/外、定时/量地上/下调Nr5a2和SALL4表达，检测Nr5a2/SALL4在GCSCs自我更新中的作用；统计分析临床胃癌样本和随访资料，探讨Nr5a2/SALL4表达状态在胃癌预后评估中的价值。本研究结果有望为针对GCSCs抑制胃癌恶性生长的治疗策略提供潜在的干预靶点和实验依据。

胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其临床治疗效果不佳的主要原因是进展期胃癌恶性生长，广泛转移，治疗后易复发。肿瘤干细胞被认为是肿瘤细胞恶性增殖的“种子细胞”，而肿瘤干细胞的自我更新特性是肿瘤恶性生长的源动力。我们前期研究发现胚胎干细胞标志物SALL4+胃癌细胞具有肿瘤干细胞的自我更新特性，并且转录因子Nr5a2是维持SALL4+胃癌干细胞自我更新的关键基因，因此我们提出假说：“Nr5a2可能通过转录激活SALL4表达，参与维持SALL4+胃癌干细胞的自我更新能力”，从而揭示Nr5a2/SALL4分子维持胃癌干细胞自我更新的分子机制，为抑制胃癌恶性生长提供新的策略。. 在研究Nr5a2调控SALL4表达的具体机制过程中，我们发现SALL4基因表达水平受到转录因子Nr5a2间接调控，并意外发现敲降Nr5a2后，传统的抗凋亡基因bcl-2的表达显著降低，Wnt信号通路和EMT相关分子表达也发生明显变化，提示Nr5a2可能与胃癌的增殖和转移相关，于是我们通过一系列体内外实验，探索Nr5a2在胃癌细胞恶性生物学特性中发挥作用的具体机制。. 主要研究结果如下：（1）SALL4分子在低分化胃癌细胞和组织中高表达，体外和体内实验证实SALL4+胃癌细胞比SALL4-胃癌细胞具有更强的自我更新能力和致瘤能力，提示SALL4分子在维持胃癌干细胞“干性”中发挥重要作用。Nr5a2在胃癌中的表达水平与SALL4正相关，SALL4基因表达水平受到转录因子Nr5a2间接调控。（2）Nr5a2在多种胃癌细胞系和胃癌组织中高表达。敲降Nr5a2可降低胃癌细胞的体外增殖能力、迁移能力和侵袭能力，细胞周期被阻滞在G2-M期，EMT进程受到抑制，Wnt/β-catenin信号通路活性降低。传统抗凋亡分子bcl-2的表达水平与Nr5a2正相关，受到Nr5a2间接调控。体内实验发现Nr5a2能促进胃癌细胞体内增殖和肺转移能力。（3）通过CHIP-sequence分析，全面研究了Nr5a2分子在胃癌发生发展中的作用，新发现多个Nr5a2直接转录激活的靶基因和多个新的Nr5a2结合motif，初步分析提示Nr5a2在胃癌组织中可能在蛋白去泛素化、紧密连接等方面发挥重要作用。本项目探索了SALL4分子和Nr5a2分子在胃癌发生发展中的作用及相关分子机制，为抑制胃癌恶性生长提供了新的治疗靶点。