结核分枝杆菌MazG功能研究及其与无毒株H37Ra毒力丢失的关系

结核分枝杆菌无毒株H37Ra与致病株H37Rv源自共同的祖先临床株H37。我们通过H37Ra全基因组测序及相关的比较基因组研究，发现H37Ra MazG高度保守区段的A219突变为E；根据H37Ra产生的过程及大肠杆菌MazG与细菌的休眠和在不利生长条件下的存活能力相关的表型，提出该突变为最初突变，且与细胞生长相关，亦有可能与体内生存相关的假说。体外实验表明该突变导致MazG的焦磷酸水解酶活性降为野生型蛋白的5%，另外我们发现耻垢分枝杆菌MazG缺失突变株的菌落形态与H37Ra尤为相似。本研究拟利用生物化学，分子生物学技术，在生化、细菌表型与整体模型等层次对结核分枝杆菌MazG开展研究，探索该突变导致酶活显著降低的分子机制，阐明结核分枝杆菌MazG的生理功能，揭示该基因突变与H37Ra特有表型，特别是与体内外持续生长中的特性的关系，探索相关的作用机理；为结核病防治提供新的研究思路。

我们通过比较基因组研究发现了Mycobacterium tuberculosis (Mt)无毒株H37Ra MazG的A219E突变。我们提出该突变与H37Ra在细胞以及体内生存能力下降相关的假说，并开展了本研究工作。MazG属于dNTP焦磷酸水解酶蛋白家族，能够将dNTP类物质水解为dNMP和焦磷酸。我们研究发现Mt MazG不但能够水解正常的(d)NTP, 还有降解具有致突变作用的dUTP 和 8-oxo-dGTP的能力，而MazG[A219E]则丧失了该水解能力，为一个功能丧失突变体。MazG被敲除的Mycobacterium smegmatis (Ms) 菌株在双氧水处理下的存活能力比野生株显著下降，同时MazG的氧化应答效应与其dNTP焦磷酸水解能力有关。感染Mt的巨噬细胞可产生活性氧（ROS）及活性氮（RNS），ROS和RNS可氧化游离的核苷酸。我们认为MazG 蛋白能够降解特定的氧化损伤型dNTP, 从而防止其掺入DNA导致错配和突变的发生。实验发现，mazG缺失的Msm在氧化条件和稳定生长期下的抗利福平自发突变频率明显高于野生菌株；通过对抗性菌株rpoB 基因的测序发现，mazG缺失菌株的C-T突变频率明显高于野生菌株，提示MazG的真正底物应该能够导致C-T 突变的发生，如5-OH-dCTP和5-CHO-dUTP等。我们对这些氧化型dNTP进行了酶促动力学常数测定。Mt MazG 对5-OH-dCTP的Km值为1.9 µM。化学遗传学实验结果显示，向mazG缺失菌株转化5-OH-dCTP后其突变频率显著上升，同时表现出剂量依赖效应，而野生株突变频率则无变化，说明5-OH-dCTP为MazG的真正底物。随后，我们在细胞模型和小鼠模型上研究了MazG与结核分枝杆菌毒力的关系。感染激活的小鼠巨噬细胞系RAW264.7后，mazG缺失的Mt的存活能力低于野生菌株。在小鼠模型上，mazG与Mt持续感染有关：感染小鼠28天之后，缺失mazG的Mt在小鼠脾脏中的存活能力比野生株低1个log单位，肺脏的病理损伤程度显著低于野生株，说明MazG与Mt的体内存活和毒力有关。该研究不但发现了一个新的参与抑制C-T突变的housecleaning相关蛋白MazG，同时揭示了Mt维持其基因组稳定性与体内生存的新机制。