ilvD基因影响结核菌株H37Ra毒力减弱的作用机制研究

Tuberculosis, caused by Mycobacterium tuberculosis, remains a leading infectious disease in humans. The avirulent M. tuberculosis strain H37Ra was derived from virulent strain H37. Investigating the basis of virulence attenuation in H37Ra is critically important to understand the pathogenesis of M.tuberculosis. We have recently determined the whole genome sequence of H37Ra and identified mutations in ilvD gene in H37Ra that are different from its virulent parent strain H37Rv. Our preliminary results have shown that in mouse model, the complement of ilvD gene restored the virulence phenotype of H37Ra to the parental levels. In order to access the role of ilvD in M.tuberculosis physiology and virulence, we will detect the gene expression levels and enzyme activity of ilvD in H37Ra and compare those with H37Rv. In addition, by creation of a ilvD gene knockout mutant H37Rv:△ilvD and the complementing strain H37Rv:△ilvD, we will investigate the growth rates and survival of the strains under stress in vitro or in animal model. These studies will shed new light on the molecular basis of virulence attenuation in H37Ra and improve our understanding of tuberculosis pathogenesis with implications of rational design of new vaccines and therapeutic agents.

阐明结核杆菌减毒株H37Ra毒力减弱的机制对明确结核分枝杆菌野生株致病机制具有重要意义。申请人课题组前期工作发现与有毒株H37Rv比较，减毒株H37Ra中存在ilvD基因的突变，进一步对H37Ra回补Rv株的ilvD基因后，发现可回复减毒株的毒力，并在感染小鼠实验模型中得到了证实。为了明确ilvD是否为H37Ra毒力减弱中的一个关键基因, 以及ilvD基因影响结核分枝杆菌毒力的分子机制，本课题拟通过基因表达的检测，基因酶活分析等技术考察H37Ra中ilvD的表达，以及突变对基因功能的影响；通过构建H37Rv中ilvD基因缺失突变株H37Rv:△ilvD以及相应回补表达株，考察H37Rv:△ilvD在体外压力环境中的生长，体内生存以及病理的情况，最终阐明ilvD基因影响H37Ra毒力减弱的分子机制，为寻找新的抗结核药物靶标及疫苗开发奠定基础。

结核病目前仍然是世界范围危害人类健康的主要传染病之一。阐明结核分枝杆菌减毒株的毒力减弱机制对明确结核杆菌的致病机制具有重要意义。本课题主要研究ilvD基因对结核杆菌毒力的影响及其引起毒力减弱的分子机制。本课题首先完成了结核杆菌H37Rv ilvD蛋白的克隆表达与纯化，证实了ilvD在结核杆菌内的功能是发挥二氢酸脱水酶(DHAD)活性，并完成了酶动力学的分析。通过体外的表型检测，我们发现ilvD基因的缺失会导致分枝杆菌发生支链氨基酸（BCAA）营养缺陷，导致ilvD敲除株的生长曲线收到了明显抑制，在培养基中加入三种BCAA的添加剂后ilvD敲除株的生长能够基本恢复到野生株的表型。ilvD基因的缺失也会明显降低分枝杆菌对氧化压力的应答。通过构建H37Rv ilvD敲除与回复菌株，我们在细胞实验和小鼠感染模型中均证实了ilvD缺失菌株在巨噬细胞或小鼠体内（肺脏和脾脏）的存活率和增殖能力较野生株明显下降，毒力明显减弱。ilvD回复菌株则能够恢复与野生株同样的存活和增值能力，明确了ilvD是影响H37Rv毒力的关键基因。本课题也研究了ilvD基因影响结核杆菌毒力和巨噬细胞内存活能力的分子机制，证实了ilvD是NO在巨噬细胞内发挥对分枝杆菌杀伤作用的关键作用靶点。NO通过抑制ilvD的酶活功能，阻断BCAA的代谢和合成，最终影响了细菌的增殖和存活。我们的研究同时发现，NO对ilvD的抑制作用主要发生在处于对数生长期的细菌，能够明显降低其在巨噬细胞内的增殖和存活能力。此外，我们也对ilvD重组蛋白在结核病血清学诊断中的价值和应用进行了评估，证实了ilvD作为血清学诊断抗原，其特异性抗体IgG诊断活动性结核病的敏感性为66.4%，特异性为91.6%，与其它血清学诊断抗原联用，能够明显提高结核病诊断的准确率。我们的发现有助于阐明ilvD及BCAA代谢通路对结核杆菌毒力及存活的影响和机制，为寻找新的抗结核药物靶标及疫苗开发奠定基础。