高羊茅FapDREB2基因功能及转录调控机理研究

DREB2转录因子主要参与干旱胁迫应答反应，过表达DREB2可提高转基因植物非生物胁迫耐受力。DREB2转录因子响应逆境胁迫的调控机理已成为研究热点，而异源多倍体中克隆得到的DREB2甚少。高羊茅是异源六倍体的草坪草和牧草资源，申请者已从其中克隆出具有转录结合活性的FapDREB2,该基因参与干旱、高盐胁迫诱导反应。本项目以此为基础，分析FapDREB2的转录调控区域是否具有负调控区，并进行亚细胞定位；利用高通量RNA测序（RNA-Seq）研究FapDREB2转录因子调节的靶基因，从转录组学角度剖析FapDREB2转录调控分子网络和可变剪接机制；通过不同类型启动子驱动FapDREB2转基因植株的表型和抗性指标分析，详细研究FapDREB2基因功能。本研究将在理论上加深对DREB2转录因子非生物胁迫诱导调控机制的认识，在实践上加快 FapDREB2在高羊茅和其他植物的抗逆基因工程育种的步伐。

高羊茅（Festuca arundinacea）是禾本科羊茅属多年生草本植物，是南方绿期最长的冷季型草坪草。高羊茅是异源六倍体，遗传背景复杂，基因组大，可参考的基因组信息量少。高羊茅转基因及转录组学研究有助于加快高羊茅分子机理研究，推动抗逆基因工程育种进程。课题组前期在干旱胁迫的高羊茅叶片中克隆得到1个DREB2s转录因子基因（FapDREB2），该基因参与干旱、高盐胁迫诱导反应。研究发现：1）FapDREB2序列中没有蛋白降解信号肽PEST序列，表明该基因C末端保守转录激活区没有负调节区，不受蛋白降解信号肽PEST调控。2）FapDREB2编码蛋白仅在细胞核中表达，符合转录因子的亚细胞定位特征。3）对豆科模式植物蒺藜状苜蓿的生物信息学分析表明，不同物种的DREB亚家族蛋白的YRG元件具有保守性，该类基因在7种组织中分布不同，其中根部表达水平最高。4）转基因研究结果表明：潮霉素抗性转FapDREB2基因愈伤细胞筛选时，应根据不同高羊茅基因型选择潮霉素浓度和筛选频度；组成型CaMV35S启动子驱动的FapDREB2基因在高羊茅中有基因沉默的可能。5）RNA-seq测序和数字基因表达谱分析结果表明：苗期高羊茅经受6，12，18，24h的PEG 6000胁迫处理，24h库中差异表达基因数最多，且76%为上调基因。4个库的差异表达基因显著富集的上调途径有‘核糖体’，‘植物病原体相互作用’和‘植物激素信号转导’；下调途径有‘缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸降解’和‘植物激素信号转导’。早期干旱响应的转录组学动态分析发现，旱胁迫24h，高羊茅相关旱胁迫基因大量表达，其中包括大量干旱相关转录因子基因，为深入研究高羊茅干旱胁迫的分子机制提供重要生物信息。6）分别以DREB2和SGR（Stay Green）登记序列为探针对转录组数据库进行本地Blast（Local Blast），分别筛选获得早期旱胁迫诱导上调特异表达的DREB2基因和SGR基因各3个，这些候选基因可用于高羊茅的抗旱机制和分子抗性育种研究。本研究建立了高羊茅转FapDREB2基因技术体系及苗期旱、盐等胁迫评价体系。高羊茅转录组深度测序和数字基因表达谱技术揭示24h内旱胁迫下高羊茅转录组动态变化特征，所形成的旱胁迫应答转录组学研究结果及对旱胁迫相关基因的挖掘有助于探明高羊茅干旱胁迫调控机制，为高羊茅分子育种提供优良候选基因。