迟钝爱德华氏菌H-NS和EsrB共调控T6SS效应子EvpP分子机制的研究

迟钝爱德华氏菌是水产养殖业中危害极大的革兰氏阴性菌，其致病机理目前仍不完全清楚，已发现六型分泌系统（T6SS）效应子EvpP在其侵染过程中起重要作用，前期研究还发现全局调控因子组蛋白样类核结构蛋白H-NS和双组分系统EsrA/EsrB的响应调节蛋白EsrB对EvpP均存在调控作用。本申请旨在研究迟钝爱德华氏菌H-NS和EsrB对EvpP的调控方式，分析H-NS和EsrB在调控过程中的相互关系，确定H-NS和EsrB共调控EvpP的分子机制，并进一步考察体外不同环境压力以宿主体内环境对调控过程的影响，为未来系统研究迟钝爱德华氏菌侵染机制研究奠定基础，也为筛选针对该菌病菌有效的疫苗靶点提供理论基础。

迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)是水产养殖业中危害极大的革兰氏阴性兼性胞内寄生菌。目前已发现六型分泌系统(T6SS)效应子EvpP 在其侵染过程中起重要作用。组蛋白样类核结构蛋白H-NS广泛存在于革兰氏阴性菌中，可以特异性沉默通过水平基因转移而来的异源基因。前期研究发现E. tarda EIB202 EvpP 蛋白编码基因evpP的GC含量较整个基因组来说偏低，为水平转移获得。本项目研究了迟钝爱德华氏菌H-NS对EvpP调控的分子机制，根据E. tarda EIB202全基因组信息，发现其基因组中有两个hns基因(ETAE_1505和ETAE_2968)，这两个hns基因所编码的蛋白与大肠杆菌H-NS的同源度分别为81%和60%。通过构建hns突变株、过表达株及回补株并对不同环境压力下各菌株的生长及致病力进行考察，发现hns突变对E. tarda的生长状态及对斑马鱼的半致死剂量均无明显影响，而可以抑制在蓝旗太阳鱼细胞的内化。研究发现H-NS对EvpP的转录具有抑制作用，体外EMSA实验结果表明H-NS可以直接结合evpP 基因启动子和开放式阅读框(ORF)区域的序列，而H-NS-1505对该区域DNA的亲和力远大于H-NS-2968。进一步通过DNA酶I足迹实验获得了H-NS-1505对evpP基因区域结合位点的精确序列，证明H-NS可直接结合在evpP启动子上下游及ORF中的多个高AT含量序列上，进而通过H-NS自身多聚化及架桥作用来进行沉默作用的分子机制。此外，本研究还探索了H-NS 和EsrB对EvpP共调控的关系，细菌双杂交实验结果表明EsrB和H-NS 之间并非通过直接结合作用，EsrB通过结合esrC启动子调控EsrC蛋白的转录，进而由EsrC调控EvpP。此外，HNS除参与evpP的调控外，还对T6SS效应子EvpB和EvpC均有调控作用，其调控的分子机制类似EvpP，相应的结合序列被找出，同时H-NS蛋白与DNA结合密切相关的两个氨基酸也被确定。通过本项目的研究确定了迟钝爱德华氏菌H-NS对T6SS效应子EvpP分子机制，为进一步探索T6SS 作用机制及迟钝爱德华氏菌侵染机制奠定基础。