髓核间充质干细胞的分离、鉴定与功能的探索性研究

不同发育阶段椎间盘髓核组织中是否存在髓核间充质干细胞目前尚未明确。在既往国家自然科学基金重点项目研究中，我们在培养髓核组织细胞过程中发现，体外培养150余天的髓核组织细胞中存在CD73、CD90、CD105、HLA-ABC阳性，CD45、CD34、HLA-DR阴性的靶细胞群，且可向软骨细胞、脂肪细胞及成骨细胞成功诱导分化，这提示了髓核组织细胞中有干细胞的存在；但髓核间充质干细胞的生物学活性和功能变化仍不清楚，故本课题拟采集不同发育阶段来源的髓核组织标本，分离并扩增髓核间充质干细胞，对其进行干细胞属性鉴定。在明确干细胞存在确切证据基础上，进一步评估其在体内外的生物学活性和功能。本研究将为深入认识不同发育阶段髓核组织中髓核间充质干细胞的功能变化情况提供重要科学依据。

干细胞是维持组织或器官正常功能的关键。几乎所有的成体组织中存在间充质干细胞。由此，髓核组织中是否存在间充质干细胞成为椎间盘研究关注的热点。在前期国家自然科学基金研究中，课题组已经发现髓核组织中存在具有间充质干细胞表面标志物特征，并能向成骨、成软骨和成脂肪诱导分化的细胞。本项目对髓核间充质干细胞的分离和提纯，以及其生物学活性进行了进一步的研究。从4个实验研究来探索正常和退变的髓核组织中是否存在髓核间充质干细胞以及其功能是否有异同、分离提纯以及标记干细胞的优选方案，并对慢病毒转染人端粒逆转录酶至髓核细胞后细胞的可行性及效果。. 本研究首先对正常和退变髓核中获取的髓核间充质干细胞进行了鉴定和对比，发现髓核间充质干细胞存在于上述两种髓核组织中，表面标记物具有干细胞特性（CD73、CD90、CD105阳性，CD45、CD34、HLA-DR阴性），并能向成骨、成软骨和成脂诱导分化。正常髓核组织来源的髓核间充质干细胞具有较强的细胞代谢活性（p<0.05），较强的干性维持基因(Oct4和Nanog)表达（p<0.05）。然后，比较了贴壁法和流式细胞分选技术对髓核间充质干细胞的提纯，发现流式细胞分选技术分选的髓核间充质干细胞的纯度较高，并具有更强的增值能力（p<0.05）和分化能力(p<0.05)。此外，还在不同时间点和不同浓度使用EdU体外标记髓核间充质干细胞，发现使用50μmol/L，37°C孵育24小时标记效果好（p<0.05），并且对细胞增殖影响小(p<0.05)，是体外标记人髓核间充质干细胞的最适合条件。最后，利用慢病毒载体将人端粒酶逆转录酶转染至髓核细胞，发现转染后表达人端粒逆转录酶的髓核细胞的端粒酶活性恢复、保持了端粒的长度、降低了细胞衰老，并增加了细胞增值率（p<0.05）。. 本项目明确了正常和退变髓核组织中均可获得髓核间充质干细胞，但正常髓核组织获取的髓核间充质干细胞功能更好；证实流式细胞分选技术分离提纯的髓核间充质干细胞具有纯度高、增殖和分化能力强的优势；发现了EdU是标记髓核间充质干细胞的可行方案，并摸索出最适条件；还证实了慢病毒转染人端粒酶逆转录酶至髓核细胞是安全的、有效的。总之，本项目证实了髓核间充质干细胞的存在，评估其生物学活性和功能，并优化筛选和标记方案，为更好的了解髓核间充质干细胞，以及其在细胞治疗和组织工程中的研究奠定了基础。