健脾清热活血中药介导Wnt/β-catenin-TCF通路干预溃疡性结肠炎相关癌变的研究

本项目基于Wnt/β-catenin-TCF通路中关键基因β-catenin突变介导溃结癌变角度，以方测证，探讨健脾清热活血中药干预溃结相关癌变的机制。制作溃结癌变小鼠模型，从在体和离体实验两个方面，应用透射电镜、组织芯片、免疫荧光染色、免疫沉淀、Western blot、Real-time PCR、流式细胞仪等技术方法，通过对比研究溃结癌变小鼠结肠组织形态及人结肠癌SW480细胞形态、增殖及凋亡变化、β-catenin、TCF-4、cyclinD1、c-myc等蛋白及mRNA表达以及健脾清热活血中药干预作用，从分子水平阐明溃结癌变中医理论"脾虚血瘀，湿毒内蕴"本质，揭示健脾清热活血方药干预溃结癌变的作用机理与有效靶点，研究成果将可能对溃结癌变中医药防治策略产生重要影响。

目的：基于检测Wnt/β-catenin-TCF通路中相关指标及其下游靶因子C-MYC、CyclinD1等指标变化，探讨健脾清热活血中药干预溃结相关癌变（UCAC）的机制。.方法：⑴在体实验：120只Balb/c小鼠按体重随机分为6组，正常组、模型组、西药组、治疗组（低、中、高剂量）每组20只。采用DMH/DSS复合法制备UCAC模型；自第4周起，分组干预连续16周。第20周末处死全部小鼠。应用光镜、透射电镜检测结肠组织病理变化；应用分子生物技术检测Wnt/β-catenin-TCF通路中相关指标变化。⑵离体实验：SW480细胞随机分为空白组、治疗组、对照组；采用血清药理学方法分组干预结肠癌细胞SW480（24h），应用MTT法检测细胞增殖、流式细胞仪检测细胞周期、凋亡率；应用分子生物技术检测Wnt/β-catenin-TCF通路中相关指标变化。.结果：⑴在体实验:光镜+电镜结果，模型组见溃疡形成、高级别上皮内瘤变、部分可见浸润癌；治疗组见部分溃疡及低级别上皮内瘤变，未见癌，其病理组织学评分较模型组明显下降，中、高剂量组疗效更为明显；电镜下模型组见大量大小不等、排列紊乱的上皮细胞，胞核不规则、核仁增大并上移；治疗组见上皮细胞体积明显变小，核染色质边集、凋亡小体形成。模型组结肠β-catenin、C-myc 、CyclinD1、TCF-4蛋白及其mRNA呈高表达特点；治疗组结肠β-catenin、C-myc 、CyclinD1蛋白及其mRNA 表达均呈下降趋势，与模型组比较，有统计学意义。但TCF-4蛋白及其mRNA表达较模型组未见明显差异。⑵离体实验：10%含药血清组24h抑制率为57.86%，空白组24h抑制率为37.37%，有统计学差异。与空白组比较，治疗组S期细胞增多、G1期细胞减少，且与药物浓度有剂量依赖性；与空白组细胞凋亡率比较，治疗组SW480细胞凋亡率呈上升趋势，有统计学差异。治疗组β-catenin及CyclinD1表达，较空白组呈下降趋势；而TCF-4、C-myc表达与空白组比较无明显差异。治疗组β-catenin表达以胞膜为主，胞质/核异位表达逐渐下降，与空白组比较，有统计学意义。结论：健脾清热活血中药可能通过调控β-catenin表达，促进其降解，减少C-myc、cyclinD1转录，发挥防治UCAC生物学效应。