基于MRGPRX2/CMC-IT-TOF的药物类过敏物筛选及质量控制方法基础研究

The safety issues of the widely used traditional Chinese medicine preparations have always been a hot topic to researchers, as well as inpatient/outpatient. With cell membrane chromatography (CMC) as kernel, applicants have finished the study on "identification/screening" of allergic components targeted on IgER and H1R. And our project “Basic research on safety and effectiveness evaluation of Chinese medicine by CMC” has been awarded excellent concluding in 2017. Basis on those, we will try to carry out following items relating to the latest reported MRGPRX2 target which induces anaphylactoid reactions during this project: to develop two-dimension CMC combined with IT-TOF, identify/screen MRGPRX2 potential anaphylactoid components with high specificity and selectivity, further study the KD constant between anaphylactoid components and MRGPRX2 using CMC technique. Through in vivo and in vitro assays, verification activity and effectively of these components from TCM preparations; furthermore, give a deep study molecular mechanism of anaphylactoid components using KIT deficits, MRGPRB2 gene knockout mice, gene interference, RT-PCR as well as immunoblotting technique established previously. Meanwhile, to establish fingerprint spectrum of TCM preparations and herbs containing anaphylactoid components through HPLC fingerprint technique. With the development of the project, we may provide new strategy and methods for evaluating the safety of TCM preparations.

临床上广泛应用的中药制剂安全性问题一直是广大患者和科研人员关注的热点。2017年课题组优秀结题完成“细胞膜色谱技术用于中药安全性和有效性评价的基础研究”，建立了IgER及H1R为靶标的过敏组分“识别/鉴定”研究体系。申请者在此基础上，利用首次报道MRGPRX2类过敏受体为对象，以细胞膜色谱法（CMC）为核心，建立CMC二维联用IT-TOF方法，高选择性地从中药制剂中“识别/鉴定”靶向MRGPRX2类过敏组分，进一步利用CMC研究类过敏组分与MRGPRX2的平衡解离常数，深入探讨其相互作用关系。通过细胞学、动物学验证，明确中药制剂及相关药材引起类过敏反应组分效应，并利用已建立KIT功能缺失、MRGPRB2基因敲除小鼠，基因干扰、RT-PCR及免疫印迹技术明确类过敏组分作用分子机制。同时，利用HPLC指纹图谱技术建立包含类过敏组分的中药制剂及药材指纹图谱，为中药制剂安全性评价提供新技术和方法。

中药是临床上广泛应用的有效药物制剂，而其安全性一直是人们关注的热点。申请者及团队在2012年国科金重点项目"细胞膜色谱技术用于中药安全性和有效性评价的基础研究"结题后，继续开展了深入基础性研究，实现了细胞膜色谱法高选择性地从复杂体系中"识别/鉴定"目标组分的研究目标。在此基础上，本项目将过敏相关受体：MRGPRX2、H1R、FcεRI通过基因工程手段制备过表达细胞，并用于高表达细胞膜色谱固定相的构建。通过构建高表达MRGPRX2等细胞膜色谱（CMC）模型，对药物制剂及相关中药材中可能引起类过敏反应的致敏组分进行筛选研究；进一步结合生物活性验证了相关组分的活性，从中药等药物制剂中发现了多种过敏组分；利用高表达受体CMC-online-HPLC-MS/MS二维色谱分析系统，以及HPLC指纹图谱技术，研究建立分别包含类过敏组分的色谱分析方法，并用于药物制剂的过程分析，为药物制剂安全性评价提供新技术和方法；通过前期筛选和初步活性验证，也发现了多种具有抗过敏活性天然来源成分，并深入评价了作用机制，为抗过敏药物的开发提供了新母核及临床前研究数据。课题围绕肥大细胞特异表达过敏受体MRGPRX2、H1R、FcεRI等受体具体开展了如下实验并获得相应研究成果：（1）建立基于“MRGPRX2类过敏反应相关的致敏组分”高灵敏筛选与检测方法，初步揭示引发药物类过敏反应的物质基础和作用规律；（2）针对类过敏组分引发的过敏反应，开展相关体外细胞水平与体内动物水平基础实验，初步阐明引发类过敏反应效应与机制；（3）建立了5-HMF等类过敏组分的制备及致敏组分理化性质分析，与相关标准制定。（4）筛选拮抗MRGPRX2、FcεRI等过敏受体化合物，分析受体与抗类过敏化合物的结构作用关系，开展相关体外细胞水平与体内动物水平基础实验，初步分析化合物治疗过敏疾病的效果与作用机制；同时，开展了具有潜在抗IgE介导过敏反应天然产物的筛选与功能分析研究。研究的部分成果已获得专利转化，形成外周血MRGPRX2浓度ELISA检测试方法及试剂盒，进一步在临床过敏性疾病，如：慢性荨麻疹、特应性皮炎、过敏性哮喘等的辅助诊断中广泛应用，并指导临床合理用药，减轻患者痛苦、缓解医疗资源压力。