水杨酸诱导雨生红球藻积累虾青素的分子调控机制研究

雨生红球藻是自然界中生产天然虾青素最理想的工具，但合成效率不高。因此，找到有效的调控手段并弄清其调控机制是提高雨生红球藻中虾青素生产效率的关键。水杨酸(SA)能诱导许多植物次生代谢物的生物合成，我们发现SA也能诱导雨生红球藻大量积累虾青素，但其中具体的调控机制还不清楚。本项目以此为切入点，首先通过real time-PCR技术研究SA诱导对八个虾青素合成相关酶基因表达模式的影响，找到限速酶及关键酶基因，明确SA对雨生红球藻虾青素合成途径的调控方式及调控的潜在靶基因；其次采用比较转录组的方法，通过抑制差减杂交（SSH） 构建cDNA文库，寻找SA诱导雨生红球藻细胞产生的差异表达基因，再结合生物信息学和表达模式分析筛选出重要的调控因子；最后通过酵母单/双杂交验证这些调控因子的功能，分析这些调控因子与虾青素合成相关酶基因之间的关系，从而初步阐明SA诱导雨生红球藻大量积累虾青素的分子调控机制。

虾青素是一种是一种高附加值的次生类胡萝卜素，在水产养殖、食品药品和保健品等领域应用广泛。雨生红球藻能在多种逆境胁迫条件下迅速合成并大量积累虾青素，是目前国内外首选的天然虾青素合成工具。我们项目组前期研究发现一定浓度的水杨酸(SA)可能会诱导红球藻大量积累虾青素，但其调控机制不清楚。因此，我们首先通过虾青素含量测定比较了不同浓度SA诱导红球藻积累虾青素的效果，结果发现诱导后18天，25mg/L的SA处理组虾青素含量达到2.74mg/L，50mg/L的SA处理组虾青素含量达到1.63mg/L（此时对照组虾青素含量只有0.391 mg/L）。其次，我们通过荧光定量PCR研究了在一定浓度SA诱导下8个虾青素合成相关酶基因的mRNA表达模式差异，结果表明，25mg/L和50mg/L的SA均能显著促进上述8个酶基因的转录上调。SA诱导下的虾青素积累主要是受到ipi-1、ipi-2、psy、bkt、crtR-B、crtO在转录水平上的调控、lyc基因在转录后水平上的调控以及pds基因在转录和转录后水平上的调控。最后，我们已经完成了雨生红球藻在一定SA诱导条件下的转录表达谱分析，包括原始数据的统计和拼接、unigene的功能注释、GO分类、代谢通路和差异表达以及转录因子AGRIS分析等。结果表明，SA主要通过差异基因的下调来影响红球藻的多种生理代谢机制。虾青素代谢途径分析发现在SA诱导后24小时，4个基因psy, pds, zds, crtR-B的转录上调可能与虾青素积累增加有直接关系。针对转录因子AGRIS分析已经筛选了37个差异基因作为可能的转录因子，包括Myb, B3, E2F/DP, ERF, HSF, C3H, NF-YB, NF-YC, WRKY family 等。通过功能预测发现其中Myb, WRKY, E2F/DP 和HSF可能对SA诱导引发的红球藻防御体系相关。目前，我们正在进行雨生红球藻在SA诱导条件下的蛋白质组iTRAQ初步分析，具体包括差异蛋白的质谱鉴定、生物信息学分析（GO分析）和蛋白质网络互作分析等等。