基于SiRNA技术探讨凉血通络方抑制脉络膜新生血管作用机制

Choroidal neovascularization (CNV) is one of the major diseases of serious harm to human health, cause of the high incidence of the aging society and the extraordinary rate of blindness. In this study, we use traditional Chinese medicine theory and the gene technology(SiRNA) that specific and efficient inhibition of vascular angiogenic factors understanding of CNV, find its pathogenesis from collateral disease, we grounded our view on "heat, blood stasis", select Chinese crude drug of southern Yunnan for cooling blood and dredging collaterals treatment, the earlier period has obtained definite curative effect on clinical. But its mechanism and the influence of CNV regulatory factor expression are still unclear. In this study, we establish chinchilla BN rats CNV model and primary umbilical endothelial cell cultures, administer cooling blood and dredging collaterals and SiRNA treatment, observe the OCT and FFA changes in BN rats macular area, observe the ultrastructural changes of retina and choroid in virtue of transmission electron microscopy, determin the expression of CNV regulatory factor (VEGF,bFGF,PEDF,Ang-1), study the effect and mechanisms of cooling blood and dredging collaterals combine SiRNA to treat CNV. Through this study, it would reveal the mechanism of cooling blood and dredging collaterals combines SiRNA, and provides a novel method and the scientific basis for the clinical treatment of CNV diseases.

脉络膜新生血管(CNV)类疾病（湿性老年性黄斑变性等）是老龄化社会发病率、致盲率极高、严重危害人类健康的重大疾病之一。本课题基于中医理论，应用具有特异血管生成因子的基因技术(SiRNA)认识CNV，从络病学寻找其病机，以“热、瘀”立论，选用滇南特色中药行凉血通络治疗，前期在临床上取得了一定疗效，但其对CNV调控因子表达的影响及其作用机制需进一步深入研究，本研究在前期研究基础上，建立BN大鼠CNV模型及原代脐内皮细胞培养，行凉血通络方及SiRNA技术干预，观察BN大鼠黄斑区OCT、FFA的动态变化、透射电镜视网膜脉络膜病理组织超微结构改变及测定CNV调控因子(VEGF、bFGF、PEDF、Ang-1)的表达，深入探讨凉血通络方联合SiRNA技术治疗CNV的作用及其机制。通过本研究，将揭示凉血通络方联合SiRNA技术抑制CNV的协同作用机制，为临床治疗CNV类疾病提供一种新的手段和科学依据。

项目的背景.脉络膜新生血管(CNV)类疾病是老龄化社会发病率、致盲率极高、严重危害人类健康的重大疾病之一，因 CNV 可造成患者视力严重损害，具有不可逆性，是一类常见的致盲性眼病，目前国内外尚无彻底治疗手段，是世界公认的难治性眼底病之一。如何有效治疗CNV是全球眼科界共同关注的热点问题，故开展 CNV的治疗研究。.主要研究内容 .建立BN大鼠CNV模型，将CNV模型鼠按照分组给药，建模后按实验计划行FFA、OCT 检查，分析形态学改变，7周处死大鼠，取眼球进行视网膜脉络膜形态学观察，调控因子VEGF、bFGF、Ang-1、PEDF 的mRNA 和（或） 蛋白质表达水平测定；制备凉血通络方含药血清，培养、鉴定人脐静脉内皮细胞，按分组给予含药血清、SiRNA干预，流式细胞仪检测细胞生长情况，检测 VEGF、bFGF、Ang-1、PEDF 的RNA 和（或）蛋白质表达水平。.重要结果.VEGF、siRNA干扰联合“凉血通络方”应用对于激光诱导的CNV有明显抑制作用，能更有效的阻止血管渗漏和抑制新生血管的形成的作用，为CNV的治疗提供了新思路。.关键数据.在行玻璃体腔注射VEGF 、siRNA治疗的基础上，再加用“凉血通络方”能有效减小眼底荧光渗漏面积、CNV厚度，能有效抑制脉络膜新生血管生长，疗效高于RNA干扰组。进一步研究显示，两者联合应用，不仅可以降低VEGF蛋白表达及VEGF、mRNA水平，还可增加色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor，PEDF) 的蛋白表达及mRNA水平。PEDF属丝氨酸蛋白酶抑制因子，是已知的最强的内源性血管抑制因子，可通过促进活化的血管内皮细胞凋亡从而引起新生血管的退化，抑制新生血管形成，PEDF也可通过调节其他因子如VEGF、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor,FGF）的表达抑制血管增生。.科学意义.从络脉“热、瘀”立论，根据前期临床研究，选用滇南特色中药行“凉血通络”来认识并治疗CNV类疾病。同时结合能特异性、高效的抑制 RPE 细胞的 VEGF表达的SiRNA 基因技术。通过实验验证二者能协同产生更有效阻止血管渗漏和抑制新生血管形成的作用，属于治疗的创新。为临床治疗CNV类疾病 提供一种新的手段和科学依据。