基于脂肪酶界面反应机制的虚拟筛选技术的建立及其在嗜热酯酶功能进化中的应用

本研究以嗜热酯酶AFEST为出发酶，以脂肪酶界面反应机制为理论基础，应用计算生物学技术建立以Monte Carlo procedure限定功能分析酯酶Lid螺旋肽段插入界面的IMPALA（integral membrane protein and lipid association）虚拟筛选技术，以两极性和螺旋肽段插入油水界面角度为判定指标，对嗜热酯酶Lid结构域进行再设计，指导酶的体外进化。发现嗜热酯酶lid结构在油水界面运动性的调控因子；总结Lid结构域α2螺旋肽段不同疏水模式和疏水梯度对酶功能的影响，校正和完善虚拟筛选模型，最终实现嗜热酯酶向嗜热脂肪酶功能的转换。本项目的实施将开创高温脂肪酶功能进化的新途径，是对酶区域进化理论的有益补充，是首次将虚拟筛选技术应用于界面酶反应复杂系统的创新性探索。该课题的实施不仅为界面酶结构－功能关系研究开拓新的领域，又对生物技术产业具有重大的现实意义

本项目在前期研究工作基础上，根据脂肪酶界面反应机制，应用数学方法建立油水界面模型；利用同源模建等方法构建AFEST Lid中30－50位残基突变体结构模型（包括点突变、多点突变或插入、缺失等突变）；利用计算生物学技术建立以Monte Carlo procedure限定功能分析肽段插入界面的IMPALA（integral membrane protein and lipid association）虚拟筛选模型，以两极性比值和螺旋肽段插入油水界面角度为判定指标，对AFEST Lid中30－50位肽段突变体实施虚拟筛选，力求在削弱lid结构域与催化结构域已有极性相互作用的同时，调节α2螺旋的两极性、疏水梯度或疏水模式，增强lid结构在油水界面运动性的驱动力。同时建立了新的微量滴定系统，对突变体酶进行分子构建、表达、纯化和性质表征。发现了Arg33 Glu41，Arg43，Asn44和Ser48等对酶lid结构在油水界面运动性的调节因子，总结α2螺旋肽段不同疏水模式和疏水梯度对酶功能的影响；并以此为指导，进一步通过双位点定点突变或定点饱和突变，构建筛选文库，通过已建立的高通量筛选方法，测试突变体对甘油三酯，有机磷化合物、糖酯或硫酯等水解能力；选择具有酶底物谱拓展及酶稳定性的传递两方面特性的最佳突变体为模板，对相对应的催化结构域的残基进行再设计和突变体性质测定，最终实现超嗜热酯酶向嗜热脂肪酶功能的转换。对于突变体酶晶体结构的研究正在进行中。.本项目所提出的基于脂肪酶界面反应机制的酶功能进化，是对酶分子区域进化理论的有益补充，是首次对蛋白质工程和界面工程领域诸多问题融会贯通并提升至油水界面复杂酶系统的创新性探索。同时对人才队伍进行了培养，一名赴美国博士后已出站，一名在读硕士研究生和两名毕业硕士研究生。