AFLB脂肪酶N端结构在油水界面催化反应中的功能研究

Lipases, interfacial enzymes, have been widely used in oil processing field. To fulfill the demand for the development of technology, the update of the interfacial catalytic theory in water-oil should continue. In a previous study, we found AFLB lipase, derived from Aspergillus fumigatus, contain a N terminus with 5 alpha helixes covering the active site and a atypical lid domain, implying that it may have unique catalytic behavior in the water-oil interface. In this study, we will investigate the catalytic performance of AFLB, including adsorption to the interface, selection of the substrate and catalytic behaviors by monomolecular film technology. The aim of this study is to give a global view on the functional role of AFLB N terminus involving in the catalytic behavior. This work may shed some light on the interfacial catalytic theory of lipases, and also provide the basic knowledge to the oil process application.

脂肪酶是一种在油脂加工领域重要的界面酶，为满足应用技术不断升级的要求，需要不断地完善其油水界面的催化理论。在前期的研究中，申请人发现来自烟曲霉的脂肪酶AFLB的活性中心被一个含有5个α螺旋的新颖N端结构所覆盖，且不具备典型的α螺旋样盖子结构，提示其在油水界面可能呈现特殊的催化行为。本研究以脂肪酶AFLB为研究对象，重点围绕其N端结构对脂肪酶的活性调控和底物的识别等关键问题，采用单分子层技术研究AFLB脂肪酶在界面吸附、底物选择及界面催化等特征性参数。结合结构生物计算分析，阐明AFLB脂肪酶N端结构在油水界面上构型动态变化过程对调控酶分子催化的作用机制。该研究的顺利开展可进一步完善脂肪酶界面催化理论，并推动酶工程领域的基础科学研究，同时对脂肪酶在油脂加工的实际应用具有指导意义。

脂肪酶是一种界面催化酶，在油脂加工领域重要的应用价值，不断地完善其油水界面的催化理论，可为工业酶的理性设计及应用提供科学的指导。本研究以烟曲霉脂肪酶AFLB为研究对象，采用单分子层技术研究AFLB脂肪酶在界面吸附、底物选择及界面催化等特征性参数及影响规律，阐明其N端结构对脂肪酶的活性调控和底物的识别等关键问题。本项目完成了以下的研究工作：1）在大肠杆菌宿主中重组表达了脂肪酶AFLB，酶学性质研究表明其最适合反应温度为40 °C，最适反应pH为7.5，最适底物为三丁酸甘油酯，具有严格的sn-1,3位选择性；2）制备并解析了脂肪酶AFLB晶体，分辨率为2.0 Å，PDB数据库编号为6IDY。首次发现其具有由5个α螺旋组成的独特N端亚结构域；3）AFLB“盖子结构”上关键氨基酸残基的突变（AFLB-W275A）或二硫键断裂（AFLB-C273A / C281A），可提高脂肪酶AFLB对甘油酯底物的亲和力和催化效率。4）脂肪酶AFLB的N末端亚结构域突变体AFLB-D1-59针对三丁酸甘油酯为底物的比酶活是AFLB wt的2.14倍，单分子层技术研究显示 AFLB-D1-59比AFLB wt具有更大插入压力MIP值和更高的协同因子，提示突变体对油水界面的吸附特异性提高，是导致其水解反应效率提升的主要因素。本研究进一步完善脂肪酶界面催化理论，并推动酶工程领域的基础科学研究，同时对脂肪酶在油脂加工的实际应用具有指导意义。