嗜热内酯酶活性中心区域进化构建磷酸三酯酶

有机磷化合物(包括有机磷杀虫剂和化学战神经毒剂)能不可逆抑制脊椎动物体内神经系统的乙酰胆碱酯酶，其对人及家畜等产生的强毒副作用已引起高度关注。磷酸三酯酶能有效地水解有机磷化合物，在生物防恐及医药工业有重要应用潜力。但目前大多数微生物磷酸三酯酶稳定性差，限制了其广泛应用。我们在前期研究中发现，来源于嗜热细菌Geobacillus kaustophilus HTA426的内酯酶具有磷酸三酯酶活力，结构解析表明，其与磷酸三酯酶具有相似的基本骨架，而活性部位loop结构的差异可能为形成两类酶功能差异的根源。为探讨酶分子进化途径并构建稳定的磷酸三酯酶，本项目以嗜热内酯酶为模式酶，通过loop嫁接、关键位点突变等系列分子改造技术，构建对有机磷化合物具有高效、广谱水解能力的进化酶。本项目将突破单点突变的进化局限性，发展区域进化的酶功能快速进化新途径，丰富和发展酶趋异进化的理论和实践。

有机磷化合物(包括有机磷杀虫剂和化学战神经毒剂)能不可逆抑制脊椎动物体内神经系统的乙酰胆碱酯酶，其对人及家畜等产生的强毒副作用已引起高度关注。磷酸三酯酶能有效地水解有机磷化合物，在生物防恐及医药工业有重要应用潜力。但目前大多数微生物磷酸三酯酶稳定性差，限制了其广泛应用。来源于嗜热细菌Geobacillus kaustophilus HTA426的内酯酶具有磷酸三酯酶活力，结构解析表明，其与磷酸三酯酶具有相似的基本骨架，而活性部位loop结构的差异可能为形成两类酶功能差异的根源。本项目以嗜热内酯酶为模式酶，探讨了酶分子进化途径，并构建稳定的磷酸三酯酶。取得了以下创新性成果：.1. 内酯酶 (GkaP)活性热点氨基酸 (Tyr99和Gly209)对酶底物选择性及催化活性具有重要影响。突变体Y99L对磷酸三酯酶底物的催化效率提高10倍，而对内酯酶底物的催化效率降低了15倍，两种酶催化效率比值相差大约154倍；该点突变可以导致底物谱的逆转，为新功能酶构建提供新思路；突变体G209D能显著提高两种酶的催化活力，预期可能通过加强质子转移效率，从而使酶活力提高。进一步晶体结构分析揭示了酶分子进化机制。我们的工作表明单个氨基酸取代就能影响了底物结合loop区的几何构象，从而改变“非专一性”酶对不同结构底物的识别和催化能力，该工作为理解“非专一性”酶的催化机制提供了新的线索。.2. 结合理性设计和定向进化的的策略，成功地将GkaP由一个“非专一性”酶转变成了专一化的有机磷水解酶。通过四轮定向进化，最优突变体（含七点突变）对于有机磷杀虫剂对氧磷的催化效率比野生型提高了232倍，对于其它常用但难降解的有机磷杀虫剂（对硫磷、地亚农和氯螨硫磷) 的水解速率提高了17-497倍，极大地拓宽了对有机磷杀虫剂的选择性。本研究为通过实验室进化手段创造高效的催化剂提供新实例，为有机磷毒物的降解提供了潜在的解决方案。