基于协同进化原则的蛋白质结构域重组策略及其在构建超嗜热脂肪酶中的应用

Recombining proteins with less sequence similarity would bring more mutations and then offer greater opportunities for creating novel proteins. The challenge has been that the domains from parental proteins with less sequence and structure identity often have structurally non-compatible interfaces when they are recombined, resulting in inactive chimeras. Most of the current domain recombination methods focus on direct interactions between residues. However, the coevolutionary residues, which are functionally coupling, are often distantly on structures with no direct interactions. Therefore, we believe that effective domain recombination needs not only avoiding the disruption of direct interactions but also keeping the integrity of coevolutionary residues. We supposed a combination method to solve the crossover disruption problem: on one hand, reduce the disruption of direct interactions between residues by reasonably choosing recombination sites; on the other hand, repair the coevolutionary residues, which have no direct interactions, at the domain interface. In this study, we develop a virtual screening mehtods of coevolutionary residues at domain interface, based on the protein coevolutionary principle; we recombine functional domains of mesophilic lipase Lip1 with thermophilic esterases AFEST and apAPH, the sequence identities of these enzymes are less than 20%, to construct hyperthermophilic lipase chimeras; in-depth study of the structure-function relationships of chimeric enzymes, and further optimize the screening parameters according to experimental results. Our research will provide novel enzymes for industrial application and a new perspective for the design and improvement of enzymes.

目前认为，序列同源性越低的蛋白质之间结构域重组，得到的嵌合蛋白质获得功能跃迁的可能性越大，但同时也带来更多的交叉破坏，导致嵌合蛋白质不能正确折叠并失去活力。目前的结构域重组策略大多关注残基间的直接相互作用。而功能上偶联的协同进化残基之间，可能在结构上距离较远，并不表现出直接相互作用。我们认为，有效的结构域重组不仅要避免直接相互作用的破坏，也要保持协同进化残基的完整。本项目以协同进化原则为基础，建立结构域间协同进化筛选方法，并结合重组位点的合理选择，解决低同源重组的交叉破坏问题；以同源性低于20%的中温脂肪酶Lip1和嗜热酯酶apAPH、AFEST为亲本，通过结构域重组，整合中温脂肪酶的底物特异性和嗜热酯酶的热稳定性，构建嗜热嵌合脂肪酶；研究嵌合酶的性质及结构功能关系，并根据实验结果进一步校正和优化筛选参数。本研究不仅为生物技术产业提供新酶源，更为设计和改造酶分子提供新思路。

如何设计和改造酶分子，使其获得人们所需的功能和性质是目前蛋白质工程领域研究的重要课题。结构域重组既是自然界中蛋白质进化的重要途径，也是人们改造酶分子的有效手段。同源性越低的亲本蛋白质结构域重组，获得功能跃迁的可能性越大，但也往往会由于结构域间交叉破坏，导致嵌合蛋白质不能获得正确的结构和功能。因此，发展有效的结构域重组方法，既可以实现酶功能快速改进，为生物技术产业提供新酶，又可以为酶分子的结构-功能关系研究提供理论依据。目前的结构域重组策略大多关注残基间的直接相互作用。而功能上偶联的协同进化残基之间，可能在结构上距离较远，并不表现出直接相互作用。我们认为，有效的结构域重组不仅要避免直接相互作用的破坏，也要保持协同进化残基的完整。.本项目建立了基于协同进化原则的结构域重组策略，并对序列一致性只有20%的中温脂肪酶Lip1和嗜热酯酶apAPH、AFEST进行了结构域重组。首先根据我们前期建立的关键基序指导的结构域重组方法，合理地选择重组位点，将决定脂肪酶底物特异性的lid结构域嫁接到嗜热酯酶的催化结构域上，获得了稳定表达的嵌合酶LAp、LAf；其次，根据亲本蛋白质结构域间残基进化相关性的统计偶联分析，利用计算生物学技术，建立了结构域间残基协同进化虚拟筛选突变库，优化了嵌合酶结构域间协同进化残基；并以虚拟筛选结果为指导，建立了体外突变库，利用高通量筛选方法，筛选活力提高的嵌合酶突变体，最终获得高活力高稳定性的嗜热嵌合脂肪酶；以实验结果为指导，对虚拟筛选参数进行了优化。以上研究，不仅有效整合了中温脂肪酶的底物特异性和嗜热酯酶的热稳定性，为生物技术产业提供新型酶源，更重要的是，建立了一套蛋白质结构域重组的有效策略，为解决低同源蛋白质重组交叉破坏的问题提供新思路，并为研究嗜热酶功能进化开创新途径。