Treg表位肽与细菌鞭毛蛋白共价偶联以增强关节炎模型小鼠的免疫疗效

Immunization with regulatory T-cell (Treg) epitope peptides to activate and induce Tregs, by which to suppress pathological autoimmune responses and reconstitute a new homeostasis, is a promising therapeutic regimen for autoimmune diseases such as rheumatism. However, it remains a tough issue as to how to induce potent peptide specific immune responses in vivo. Bacterial flagellin is a ligand of Toll-like receptor 5. When used as carrier, it shows strong adjuvant activity for its conjugated B-cell epitope peptides. In some particular situations, bacterial flagellin can also activate and induce Tregs. In this project, Treg epitope peptides will be covalently coupled to a recombinant flagellin varient. The conjugates will be used to immunize arthritis model mice via subcutaneous injection or nasal instillation. The immune responses as well as the therapeutic effects will be examined and evaluated. We hypothesize that the covalent conjugation of Treg epitope peptide to bacterial flagellin would effectively enhance Treg-based immune responses through flagellin itself and flagellin-adjuvanticity to Treg epitope peptide, and thereby enhance the immunotherapeutic effects on arthritis model mice. This study will offer the experimental data and the theory basis for the development of highly efficient therapeutic vaccines against autoimmune diseases.

用调节性T细胞表位肽进行免疫，激发和诱导表位肽特异的调节性T细胞，抑制过强的自身免疫应答，从而建立起新的免疫稳态，是一个很有前景的自身免疫性疾病如风湿病的治疗方案，然而要在体内有效激发表位肽特异的免疫应答依然是一个棘手的难题。细菌鞭毛蛋白是Toll样受体5的配体，在作为载体时对B细胞表位肽有极强的佐剂作用，在特定情况下能够激发和诱导调节性T细胞。在本项目中，我们拟将调节性T细胞表位肽与细菌重组鞭毛蛋白变异体进行共价偶联，所制备的偶联肽以皮下注射或滴鼻免疫的方式免疫关节炎模型小鼠，进行免疫应答检测和疗效评估。我们假设，调节性T细胞表位肽与细菌鞭毛蛋白的共价偶联，一方面通过鞭毛蛋白本身的作用，另一方面通过鞭毛蛋白对调节性T细胞表位肽的佐剂作用，能有效增强基于调节性T细胞的免疫应答，从而提升对关节炎模型鼠的免疫治疗效果。这一研究将为制备高效的自身免疫性疾病的治疗性疫苗提供实验数据和理论依据。

由于自身免疫性疾病发病机制的复杂性以及治疗药物的局限性，用调节性T细胞表位肽进行免疫，激发和诱导表位肽特异的调节性T细胞，抑制过强的自身免疫应答，从而建立起新的免疫稳态，已经成为自身免疫性疾病治疗的一个新的方向。Toll样受体5（TLR5）属于模式识别受体家族，分布在包括抗原递呈细胞在内的很多免疫和非免疫细胞表面上，而作为TLR5配体的沙门氏菌鞭毛蛋白（FliC）是抗原递呈细胞的刺激剂，无论是与抗原融合还是偶联，对抗原都能起到非常强烈的佐剂作用。我们以往的研究显示，当FliC与一个B细胞表位肽化学偶联后，在不使用任何佐剂的情况下，在实验小鼠体内激发出该B细胞表位肽特异的系统和局部的抗体应答。在本研究项目中我们以重组FliC为偶联载体与Treg表位肽B29通过化学连接剂Sulfo-EMCS进行偶联，制备成B29T-FliC偶联产物，生物活性检测显示，偶联反应没有明显影响到作为偶联载体的FliC的TLR5配体活性。将B29T-FliC免疫C57BL/6小鼠，与未偶联的Treg表位肽相比，在没有任何其他佐剂的情况下，偶联的表位肽显著提升了小鼠脾脏中肽特异性Treg细胞的数量及其分泌抑炎细胞因子的能力。用MOG(35-55)肽免疫C57BL/6小鼠制备实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型小鼠，用Treg偶联肽B29T-FliC注射EAE模型小鼠，与对照组小鼠相比，Treg偶联肽免疫在整个疾病过程中有效减缓了EAE症状、显著降低了EAE临床评分，进一步的实验显示，Treg偶联肽显著下调了EAE模型小鼠中的炎症细胞因子IL-6和IL-17的水平，显著上调了抑炎细胞因子IL-10和TGF-β水平，并且显著上调了小鼠脾细胞中Treg细胞比例。上述实验结果表明，沙门氏菌鞭毛蛋白是一个很有潜力的Treg表位肽偶联载体蛋白，这种偶联应可极大提升表位肽对Treg细胞的刺激活性，并展现出对自身免疫性疾病的治疗作用。