硫氧还蛋白TrxA介导的单增李斯特菌运动性和抗氧化应激机制研究

Listeria monocytogenes (Lm) is an invasive food-borne intracellular bacterium that breaks the intestinal, the blood-brain, and the placental barriers. It is still elusive how circulating bacteria escape the killing of reactive oxygen species (ROS) in the niche host cells. In exposure to oxidative stress, changes in the thiol-disulfide redox status alter functions of exported proteins and result in rapid protein degradation. In our previous studies, we found that thioredoxin TrxA was essential in Lm. Deletion of trxA compromised the motility, decreased secretion of the quorum sensing molecule autoinducer-2 (AI-2), impaired integrity of flagella and attenuated the virulence of Lm in mice. To further investigate the anti-oxidant mechanism of TrxA, the disulfide forming protein MogR and GamR, key components in flagella assembly, and the quorum sensing molecule AI-2 will be exploited in Lm by mutagenesis analysis, protein-protein interaction and allyl methyl sulfide (AMS) modification approaches. To this end, the GC-MS, confocal imaging, bio-layer interferometry and fluorescence-activated cell sorting (FACS) techniques will be integrated to identify Trx modulated proteins and redox-sensitive signaling pathways. Meanwhile, infection of Lm towards epithelial cells, macrophages and mice will be carried out to evaluate the activation dynamics of gfp and luc reporter genes driven by trxA/B promoters under various stress conditions. The expression of trx triggered by ROS, released by mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), under thapsigargin (TG) and dithiothreitol (DTT) stresses will be investigated to uncover the network-derived features. Contribution of listerial TrxA in response to oxidative damage initiated by ROS will be characterized by intracellular bacteria survival assay. This will shed light on novel anti-oxidative mechanisms of Lm during times of environmental stress through thioredoxin related proteins, leading to identify new pathways for sulfur/disulfide homeostasis in intracellular gram-positive bacteria.

单核细胞增多性李斯特菌（Lm）为食源性胞内致病菌，可以突破消化道上皮、血脑和胎盘屏障。Lm在感染过程中是如何通过硫氧还蛋白（TrxA）应对氧化应激的呢？我们在前期工作中发现，缺失TrxA的Lm运动性和鞭毛形成能力减弱、群体感应信号分子AI-2分泌能力和毒力下降。本研究将从影响鞭毛组装的二硫键蛋白互作以及群体感应信息素AI-2入手，通过缺失株构建、蛋白突变和互作、巯基化和烷基化修饰、酶学活性分析等手段，利用质谱、生物膜干涉、共聚焦等技术深入解析TrxA介导的抗氧化应激机制。通过构建trx启动子与荧光素酶报告系统，检测Lm的trx如何在体内外不同应激条件下被激活的。本项目将为揭示Lm等革兰氏阳性胞内菌在消化道酸性环境中的抗氧化应激以及维持巯基/二硫键稳态机制奠定实验证据。

单增李斯特菌为食源性胞内寄生菌，可穿过宿主天然屏障引发脑膜炎和流产等，致死率高达30%。李斯特菌较强的抗应激能力对其建立感染至关重要。硫氧还蛋白（thioredoxin, Trx）是一类存在于细菌中的氧化还原蛋白，主要通过二硫键修饰参与蛋白质的折叠和功能维持。生物信息学分析李斯特菌编码一个硫氧还同源蛋白（TrxA，lmo1233基因编码），但功能未知。本研究发现：（I）李斯特菌TrxA在氧化剂肼的诱导下表达水平显著上调，缺失trxA后细菌在氧化环境下生长存活能力显著削弱，说明TrxA参与该细菌的抗氧化应激。（II）重组TrxA能够将氧化态胰岛素中的二硫键还原。将TrxA的半胱氨酸Cys28和Cys31突变后该酶活性均完全丧失，证实李斯特菌TrxA属于经典的硫氧还蛋白家族，具备保守的关键活性位点。（III）缺失trxA后细菌在Caco-2细胞上的黏附侵袭、存活及细胞间能力均显著削弱，证明TrxA在胞内感染和生存中发挥了关键作用。TrxA的表达水平受转录因子SigH调控，缺失或过表达trxA均导致细菌在小鼠脏器中的复制和增殖能力显著降低，表明TrxA维持细菌胞质内的氧化还原平衡对于其发挥致病力尤为关键；（IV）全基因组转录谱测序发现缺失trxA后导致关键毒力基因plcA、mpl、actA、hly和plcB的转录水平显著下降。RT-PCR和Western blot进一步证实TrxA参与了对该些毒力因子的转录和表达调控。等温滴定量热（ITC）试验发现，TrxA与毒力调控蛋白PrfA能够发生还原性互作，提示TrxA主要通过对PrfA的氧化还原修饰进而调控下游毒力因子的表达并介导细菌致病。（V）李斯特菌缺失trxA后无法形成鞭毛并完全丧失运动性。ITC试验发现TrxA亦能够与鞭毛合成调控蛋白MogR发生氧化互作，表明TrxA也参与了对鞭毛调控蛋白修饰及功能维持。本课题系统阐明了李斯特菌硫氧还蛋白在体内外环境中的抗氧化应激机制，以及在感染宿主过程中通过对重要毒力因子的氧化还原修饰参与细菌致病的分子机理；首次揭示了TrxA通过对鞭毛调控蛋白的修饰介导鞭毛合成的分子机制，研究对于解析李斯特菌在体外氧化应激环境适应、宿主体内的抗氧化生存及氧化还原修饰机理具有重要意义。