1,3-二磷酸甘油衍生物在革兰氏阳性胞内模式菌的膜锚定机制

The intracellular Gram-positive pathogen Listeria monocytogenes and Mycobacterium tuberculosis can inhibit the fusion of phagosomes with lysosomes and resides in a mildly acidic macrophage for a long time, therein escaping the killing of oxygen radicals. Disulfide Oxidoreductase (DsbA) and protein translocation machinery complex SecYEG of these bacteria are anchored to bacterial membrane through a 1,3-diphosphoglycerol shared structure, e.g. cardiolipin. In light of the role of 1,3 diphosphoglycerol derivatives in bacteria-host interaction during the process of infection, the DsbA and SecY machineries will be focused as reference proteins. The actin hijacking and localization dynamics of L. monocytogenes in mitochondria, lysosome and phagolysosome will be tracked by using high resolution fluorescence microscope to characterize the mechanism underlying autophagy and apoptosis. In addition, potential membrane targets will be exploited and revealed by using the L.monocytogenes marker-free mutants (DsbA and SecY deletion) and site-directed mutations. The biochemical properties of DsbA and SecY will be characterized along with their corresponding functional phenotypes inside bacterial cells. This will pave a new way by uncovering cross talk mechanism between cells and finding potential drug target based on the 1,3-diphosphoglycerol structure or membrane proteins to combat listeriosis and tuberculosis.

单核细胞增多性李斯特菌和结核分枝杆菌等革兰氏阳性胞内致病菌可以在巨噬细胞内长期存活，并能逃逸自由基的氧化杀伤作用。其二硫键氧化还原蛋白DsbA和蛋白分泌系统中的SecYEG复合体通过含有1,3二磷酸甘油骨架的心磷脂锚定在细胞膜上。为进一步阐明1,3二磷酸甘油骨架在感染过程中的作用、对细菌胞内定位的影响及其介导的膜锚定机制，本研究以单增李斯特菌为模式菌，以 DsbA和SecY为参考膜蛋白，研究在各种1,3二磷酸甘油衍生物存在的情况下，细菌在巨噬细胞内线粒体、溶酶体、吞噬溶酶体中的定位和对肌动蛋白的捕获等一系列变化以及诱发的细胞自噬和凋亡机制。我们还将分析DsbA和SecY蛋白生化特征，并在李斯特菌中进行基因敲除和关键位点（Lys残基）突变分析，阐明潜在的药物靶位以及细菌和细胞之间的膜融合和对话机制。为进一步研发能快速杀死胞内寄生革兰氏阳性细菌、且含有1,3二磷酸甘油骨架的新型药物奠定基础。

单核细胞增多性李斯特菌是自然界广泛存在的食源性病原菌，可以突破上皮、血脑和胎盘屏障，并逃逸氧自由基的氧化杀伤作用，在这一过程中二硫键氧化还原蛋白（Dsb）对于维持蛋白的稳态发挥非常重要的作用。通常，经过二硫键修饰的蛋白通过SecY分泌系统分泌到细菌外。我们发现SecY蛋白是李斯特菌蛋白分泌系统中的关键蛋白，而且其编码基因为必需基因，不能直接进行基因敲除。李斯特菌Lmo1059和Lmo0964蛋白均为DsbA-like蛋白，缺失lmo1059后，李斯特菌在普通培养基和细胞内的表型都没有发生显著变化。体外活性分析表明，Lmo1059没有氧化还原酶活性，但是却具有很强的异构酶活性，这提示Lmo1059蛋白可能是与二硫键的异构修复有关。缺失lmo0964基因后，李斯特菌在半固体培养基中的运动性和抗H2O2氧化能力也减弱，但是过量表达Lmo0964蛋白可以减弱李斯特菌毒力和运动性，这说明lmo0964在李斯特菌内的表达受到严格调控。进一步研究发现，单增李斯特菌的二硫键氧化还原酶系统（TrxA和TrxB）与细菌的抗氧化应激密切相关，trxA缺失株对H2O2的耐受力降低、对猪上皮细胞的侵袭力下降，对小鼠的致病力下降。同时trxA缺失株也丧失了李斯特菌的鞭毛并导致在半固体培养基中运动力显著下降。我们也发现电镜下的trxA缺失株没有鞭毛，这进一步说明鞭毛结构蛋白的组装或二硫键形成依赖TrxA。酶学活性结果表明TrxA蛋白具有很强的氧化还原酶活性并能加快胰岛素形成巯基，而TrxB蛋白只具有异构酶活性。本研究进一步揭示了单增李斯特菌在细胞内通过氧化还原相关蛋白介导的新型抗氧化机制。