单核细胞增多性李斯特菌二硫键形成蛋白DsbA对氧化应激、鞭毛合成和毒力的调控机制研究

Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) is an environmental facultative, foodborne and Gram-positive bacterial pathogen. The presence of disulfide bond (Dsb) forming proteins is critical for viability, mobility and formation of folded proteins. It remains unknown how L. monocytogenes adapts redox stresses occurred intracellularly upon infection, and how the DsbA proteins participate in the biogenesis of flagella proteins when L. monocytogenes exposes to extracellular environments. In this study, the roles of DsbA will be investigated by phenotypes examination and transcriptome analysis of L. monocytogenes wild type and delta-dsbA towards various oxidative stress conditions. Survival and proliferation of L. monocytogenes mutants will be evaluated in epithelial cells, macrophages and a mouse model. To further determine the effect of DsbA to the homeostasis of the thiol redox environment when L. monocytogenes exposes intracellular compartments, the mitochondrial integrity will be analyzed in response to oxidative stresses by fluorescent labeling of mitochondrial membrane and autophagy-related proteins. The disulfide bond-formation properties of DsbA during flagella biogenesis will be characterized by thermodynamic interactions to flagella regulator MogR and GamR using a quantitative isothermal titration calorimetry (ITC) assay. Substrates of DsbA will be determined by iTRAQ quantitative proteomics mass spectrometry. This study will reveal a novel mechanism by which Gram-positive bacterial flagella proteins are co-modified by DsbA and thioredoxin protein, and also shed light on an evolutionary adaptation of foodborne pathogens towards redox stresses.

单核细胞增多性李斯特菌是一种存在于环境中的革兰氏阳性条件病原菌。二硫键形成蛋白（Dsb）对于该菌在宿主体内外环境中的生存、氧化应激、运动和鞭毛生成至关重要，但机理知之甚少。在本研究中，我们将对单增李斯特菌DsbA突变株和野生型的表型及各种应激条件下的转录组进行分析；研究DsbA对上皮细胞的黏附性、侵袭力以及对巨噬细胞的毒力和对小鼠致病性的作用和影响。为了进一步确定单增李斯特菌感染细胞后DsbA对线粒体完整性的影响，我们将采用荧光标记技术研究DsbA在维持细胞内氧化还原稳态中的作用。最后我们将利用ITC技术定量分析DsbA与鞭毛调节蛋白MogR 和 GamR的热动力学互作情况，同时利用iTRAQ蛋白质组学方法，挖掘DsbA的作用底物，阐明一种由二硫键形成蛋白和硫氧还蛋白共同修饰的鞭毛蛋白合成新机制。本研究对于揭示食源性病原菌抗氧化应激的适应机制具有重要意义。

单增李斯特菌是一种重要的食源性病原菌，具有较强的环境适应和宿主内感染能力。二硫键形成蛋白（Disulfide bond formation protein, Dsb）与细菌环境应激适应和感染密切相关，但李斯特菌中该蛋白的生物学功能及分子机制尚不得知。本研究以李斯特菌二硫键形成蛋白A（DsbA）为研究对象，利用应激生物学和感染生物学等手段探索DsbA在环境应激耐受和宿主感染中的功能及作用机制。研究首次发现缺失DsbA后细菌形态变小、鞭毛合成和运动能力下降，对氧化剂铜、镉离子的应激耐受较野生株敏感，证实DsbA参与细菌抗氧化应激及运动性。缺失DsbA后细菌在上皮细胞中黏附、侵袭、在巨噬细胞中的存活与增殖以及在成纤维细胞中的迁移能力均明显降低，在小鼠体内的定殖能力显著降低，该结果首次证实DsbA参与李斯特菌感染与致病。转录组数据发现缺失DsbA导致细菌应激相关蛋白、关键毒力因子以及磷酸转移酶系统（PTS）等530个基因的转录水平显著下调，首次确定了DsbA为李斯特菌潜在的全局性调控因子。进一步研究发现DsbA与氧化应激转录因子SpxA1发生相互作用从而介导细菌在氧化应激环境中发挥关键的调控作用。更重要的是，DsbA参与李斯特菌在应激条件下对毒力调控中枢蛋白PrfA具有调控作用。结合前述结果表明DsbA在体内外复杂环境中能形成精巧的调控网络，并主要通过调控SpxA1以及PTS系统进而精确控制PrfA的转录和表达，使该些重要调控蛋白维持正常的活性并参与细菌的环境适应和宿主感染。综上，本研究首次揭示单增李斯特菌DsbA在环境适应以及体内外感染过程中发挥了关键作用并深入解析了相关分子机制，为进一步完善重要食源性病原菌的感染机制和调控网络提供了重要的研究模型，对于重要食源性胞内病原菌的污染防控和保障公共卫生具有重要理论指导意义。