分子伴侣PrsA2介导单增李斯特菌内化素B锚定与感染的机制

Listeria monocytogenes is an important zoonosis pathogen, which can invade into various cell types by the two primary internalins, InlA and InlB. In the natural low virulent strain M7, the InlB can’t anchor on the cell wall that results in significantly reducing in infection and pathogenicity compare with virulent strain. In Listeria, InlB was transported to extracellular by Sec secretion system in an unfolded linear form, which might not anchor on cell surface and exhibit abnormal function. To date, it is not clear about the mechanism of InlB anchoring and its roles in Listeria infection. Our previous study showed that chaperone PrsA2 was involved in the InlB anchoring and infection in both low virulent and virulent strains. In this project, we will construct a number of deletion mutants and genetic complements to clarify the roles and regulation of PrsA2 in InlB anchoring with the help of protein interaction, transcription regulation and pathogenic phenotypes analysis. Moreover, to further elucidate the mechanisms of PrsA2 in Listeria infection, we will use primary hepatocytes as cell model to study the roles of InlB from different anchoring status and their target molecules and signaling by immunoprecipitation-mass spectroscopy, gene knock out or overexpression and phenotypes analysis. Our findings will be helpful for enriching the pathogenesis of Listeria monocytogenes and providing novel candidate targets for the prevention and control of listeriosis.

单增李斯特菌（Lm）是一种重要的人畜共患病原菌，其入侵宿主细胞主要由内化素A和B（InlA和InlB）介导。在天然弱毒株M7中，InlB不能锚定在M7表面，导致其感染能力显著低于强毒株。InlB由Sec分泌系统以未成熟的线性形式转运至细菌表面，然而InlB转位后的成熟与锚定及其对Lm感染能力的影响尚不清楚。前期研究发现分子伴侣PrsA2影响InlB的锚定和Lm的粘附与侵袭能力。本研究拟构建prsA2相关突变株，利用蛋白互作与转录调控技术结合表型分析探明PrsA2在InlB锚定中的作用及其调控；进一步建立原代肝细胞模型，利用免疫共沉淀-质谱分析、敲除与过表达技术结合表型分析，从胞外和胞内层面分析不同锚定状态InlB在Lm感染过程中的作用及其作用的靶分子和信号通路，从而阐明PrsA2在Lm感染过程中的作用机制。研究结果有望丰富单增李斯特菌的感染机制，为李斯特菌病的防控提供新的靶点。

单增李斯特菌是一种重要的食源性人兽共患病原菌，该菌感染可以引发人和动物的李斯特菌病（Listeriosis），主要表现为败血症、脑膜炎及孕妇流产等，病死率高达30%。作为一种胞内寄生菌，其胞内感染过程主要由第一毒力岛编码的毒力调控因子PrfA、磷脂酶PlcA和PlcB、溶血素LLO、金属蛋白酶Mpl以及肌动蛋白聚集因子ActA；以及第二毒力岛编码的内化素InlA和InlB等毒力因子介导。InlB主要通过c-Met等受体结合介导单增李斯特菌入侵多种类型宿主细胞，因此，InlB能否正常锚定与该菌致病力密切相关。本项目主要研究了分子伴侣PrsA2影响单增李斯特菌InlB锚定及其致病性的分子机制。首先利用利用同源重组技术分别构建了inlB、prsA2等基因缺失株及PrsA2不同结构域缺失突变体；表达纯化了PrsA2、InlA、InlB、LLO及GAPDH等单增李斯特菌的相关蛋白，并制备了相应的多克隆抗体；通过Western blot证实了prsA2缺失影响InlB在单增李斯特菌表面的锚定；筛选相关缺失株表型发现单增李斯特菌细胞壁的壁磷壁酸（Wall Teichoic Acid, WTA）而非脂磷壁酸（Lipoteichoic Acid, LTA）的修饰影响InlB的锚定。无论是在1/2a型菌株（EGDe-prfA*）中，还是在4b型菌株（ScottA）中敲除WTA修饰相关的基因gtcA、galU及galE等基因菌显著降低InlB在细菌表面的锚定。通过细胞黏附侵袭试验、胞间迁移试验、小鼠或鸡胚脏器载菌量试验及存活试验、病理组织切片等关键试验证实InlB锚定异常导致单增李斯特菌对细胞的黏附侵袭能力、胞间迁移能力及对小鼠或鸡胚的致病力均显著下降。本研究结果表明分子伴侣PrsA2及WTA修饰相关糖基转移酶酶基因缺失显著降低InlB的锚定，进而影响单增李斯特菌对宿主细胞的侵染能力以及对小鼠或鸡胚的致病性。本项目研究结果将为深入探索单增李斯特菌感染与传播机制奠定坚实基础，对应防控李斯特菌病具有重要意义。