lncRNA在猪肝细胞脂肪转运中的功能及作用机制研究

Hepatic fat transport capability is a key factor for regulating fat deposition. LncRNA is a kind of noncoding RNA which has at least 200 nucleotides and plays a crucial regulatory role in fat transport. The preliminary study of applicant indicated Duroc and Guangxi Luchuan pig have a significant difference in fat transport of hepatocytes. By analyzing their hepatic lncRNA expression profiles, we obtained two new lncRNAs (lnc-42117 and lnc-53389) which are involved in the regulation of fat transport. To further investigate the functions and mechanisms of these two lncRNAs, this project plans to first clone their full length sequences and confirm their cellular localizations. Then use pig primary hepatocytes as a platform to study their roles in fat transport by inhibiting and overexpressing them. Finally, try to clarify the regulatory mechanisms of these two lncRNAs in hepatic fat transport from the respects of interacting proteins, expression regulation and epigenetic modification. This work can provide evidence for the regulation of fat deposition and enrich our understanding of lncRNA functional mechanism.

肝脏的脂肪转运能力是调控脂肪沉积的关键因素。lncRNA是一类长度大于200nt的非编码RNA，在脂肪转运中发挥重要调控作用。申请人前期研究发现杜洛克猪和广西陆川猪在肝细胞脂肪转运上具有显著差异，通过比较二者肝脏lncRNA表达谱，初步筛选得到两个参与调控脂肪转运的新lncRNA（lnc-42117和lnc-53389）。为了进一步研究这两个lncRNA的功能和作用机制，本项目拟首先克隆其全长，确定它们的细胞定位；而后以分离培养的猪原代肝细胞为平台，通过抑制和过表达研究它们对肝细胞脂肪转运的影响；再从lncRNA的互作蛋白、lncRNA对靶基因的表达调控和表观遗传修饰等方面，阐明lncRNA在肝细胞脂肪转运中的作用机制。研究结果可为脂肪沉积的调控提供依据，丰富我们对lncRNA作用机理的认识。

本项目以陆川和杜洛克猪为研究对象，利用高通量测序比较了陆川和杜洛克猪肝脏lncRNA的差异，开展了以下研究工作：（1）筛选参与肝脏脂肪代谢调控的lncRNA。根据测序数据，进行多项信息交叉比对选择，最终选出上调表达的前二、下调表达的前三猪肝脏差异lncRNA共五个；根据靶基因筛选出其中表达量差异比较明显的三个lncRNA，确定了接下来要研究的8个候选lncRNA。（2）lncRNA的鉴定。对8个候选lncRNA，获得其表达量、差异倍数、同源性、靶基因、基因组位置、全长等信息，依据MFE和CEN两种预测方式对其二级结构进行预测，利用定量PCR验证其在生物体内的真实表达情况，发现8个lncRNA中有7个都在杜洛克这一瘦肉型猪种中表达量较高，且大部分lncRNA定位于细胞核。（3）lncRNA在肝细胞脂肪代谢中的作用研究。随后，对lncRNA TCONS-00210072进行了重点研究。揭示了其组织分布，发现其调控肝细胞的脂肪沉积和分泌，且影响线粒体数量和ATP水平。对脂代谢相关基因的检测发现，lncRNA TCONS-00210072的过表达虽显著降低了MTP的转录水平，但并不影响其蛋白水平。利用ChIRP技术，发现lncRNA TCONS-00210072与MTP和ApoB发生互作，提示该lncRNA可能在活性水平上调节MTP和ApoB，从而影响肝脏脂肪的转运和分泌。研究结果为脂肪性状的生物技术控制提供依据，对丰富lncRNA的作用机理具有重要意义。