油酸促进灵芝液体深层发酵高产灵芝三萜的代谢调控研究

Based on our recent findings that addition of oleic acid at 0 to 3 days of the triterpenes fermentation broth significantly enhanced triterpenes yield, the proposed objective is to investigate the metabolic regulation and the roles of addition of oleic acid on the improvement of triterpenes production with Ganoderma lucidum liquid submerged fermentation. The relatively low triterpenes biosynthesis during liquid submerged fermentation with G. lucidum will be targeted for significant improvement. The G. lucidum fermentation metabolic network will be.constructed through systematic analysis of the metabolic flux. The accumulated intermediates in the mycelial fermentation broth will be investigated to determine the resulting metabolic control mechanism with the addition of oleic acid. This proposed project will elucidate the physiological conditions leading to higher triterpenes production yield by G. lucidum mycelia and to establish the metabolic network, operational model for the industrial production of triterpenes as well as the scientific basis for improvement of triterpenes biosynthesis plus defining the underlining principle for the improvement of triterpenes yield on the basis of the improvement of fermentation control process. It is conceivable that very important contributions to the biotechnology of food and medicinal fungi fermentations would.be made.

我们最新的研究表明，在灵芝液体深层发酵的第0天到第3天添加油酸可以明显提高灵芝三萜的含量。基于此，本文旨在研究灵芝液体深层发酵高产灵芝三萜的代谢调控。针对灵芝液体深层发酵中合成灵芝三萜含量较低的问题，以灵芝菌丝体为研究对象，采用构建灵芝液体深层发酵代谢网络并通过代谢流分析的方法，研究灵芝菌丝体发酵过程中中间产物的积累，通过分析添加油酸对灵芝菌丝体代谢途径的影响，确定灵芝菌丝体高产灵芝三萜的代谢调控机制。本项目预期将揭示灵芝液体深层发酵过程中合成灵芝三萜的生理学现象，实现灵芝在液体深层发酵条件下高产灵芝三萜，建立通过构建代谢网络和代谢流分析的方法来表征灵芝液体深层发酵的规律。项目的研究成果对于大规模工业化生产灵芝三萜具有重要意义，可以为食药用菌的代谢途径优化和发酵控制的理论研究提供科学依据。

传统的灵芝液体深层发酵中三萜产量较低始终是制约该产业发展的瓶颈问题。我们之前的研究表明，在灵芝液体深层发酵中添加油酸可以明显提高灵芝三萜类物质的含量。基于此，本文旨在研究灵芝液体深层发酵高产灵芝三萜的代谢调控。本项目首先基于糖酵解途径(EMP)，磷酸戊糖途径(PP)，三羧酸循环(TCA)和三萜类物质合成途径(TSP)分别构建了液体深层发酵方式下灵芝三萜合成的前体物羊毛甾醇和液体深层发酵-静置培养方式下灵芝酸R/S/T的代谢合成网络；其次，以构建的代谢网络为基础，在羊毛甾醇合成中，TSP、TCA、PP和EMP途径被不同程度加强，G6P、IPP和FPP节点被确定是可改造的柔性节点。在灵芝酸R/S/T合成中，TSP、TCA、PP和EMP途径均被不同程度加强，G6P、IPP、FPP和LAN节点分别被确定是灵芝酸R和T合成的可改造弱柔性节点和柔性节点，G6P、IPP、FPP和LAN节点被确定是灵芝酸S合成的可改造柔性节点。最后，以可改造代谢节点为基础，结合优化的油酸添加策略及发酵参数强化了液体深层发酵工艺条件下合成羊毛甾醇的代谢节点，pH调控策略结合油酸添加对羊毛甾醇产量提高最明显，达到0.97 mg/g，比对照0.51 mg/g提高了90.93%。再结合优化的油酸添加策略强化了液体深层发酵-静置培养工艺条件下合成灵芝酸R/S/T的代谢节点。静置培养10天结合添加高温除菌油酸对灵芝酸R/S/T产量提高最明显，分别达到2.00 mg/g、17.26 mg/g和9.33 mg/g，比对照0.82 mg/g、3.79 mg/g和3.82 mg/g提高了1.44倍、3.55倍和1.44倍。本项目揭示了灵芝液体深层发酵过程中合成灵芝三萜类物质的生理学现象，实现灵芝在液体深层发酵条件下高产羊毛甾醇和灵芝酸R/S/T，建立通过构建代谢网络和代谢流分析的方法表征了灵芝液体深层发酵的规律。项目的研究成果对于大规模工业化生产灵芝三萜类物质具有重要意义，也为提升灵芝三萜的发酵水平和产业化应用提供重要支撑。