液体发酵过程灵芝多糖生物合成的调控研究

In this project, effects of various metabolic regulation systems on the synthesis of polysaccharides were investigated in the submerged culture of Ganoderma lucidum. This study included two aspects: appearance (morphological characteristics of mycelial pellets) and connotation (enzymatic activities concerned to biosynthetic pathways). In addition, molecular weight, monosaccharide composition and their ratios in polysaccharides are regarded as the indexes to the characteristics of G. lucidum polysaccharides. .To this purpose, the morphology of G. lucidum pellets was characterized by graphics software and the properties of polysaccharides were studied with the help of chromatography (GC, LC). And then, the relationship between morphological characteristics and properties of polysaccharides was established. To verify and complete the hypothetic approach of polysaccharide metabolism, intermediates in biosynthetic pathway were analyzed by HPLC-TOFMS and isotopic isomers tracer method. Thus, the changes in enzyme activities and their effects on the synthesis of polysaccharide were studied by using kinetic analysis and addition of intermediates under different regulation strategies. .In this project, the biosynthesis pathway of polysaccharide will be established in the submerged culture of G. lucidum. The results obtained in this research will provide theoretical basis for the further studies of metabolic regulation and transport mechanisms in G. lucidum polysaccharide. And also, it is beneficial for the improvement of polysaccharide production by the fermentation of G. lucidum. The discovery in this study will provide an important reference to other studies about fungal polysaccharides.

本课题拟从液体发酵调控的角度，以分子量、单糖组成及其比例作为表征灵芝多糖性质的指标，从表观（菌体形态）和内涵（合成途径酶活水平）两个层面，研究不同代谢调控体系对灵芝多糖合成的影响。通过色谱（GC、LC）技术对多糖性质的分析，以及图形软件对菌体形态的分析，研究不同调控条件下菌体形态相关参数的动态变化规律及其与多糖性质的关系；通过HPLC-TOFMS以及同位素示踪法分析多糖合成途径主要中间产物，对前期研究中推断的合成途径进行验证、修订和补充；在此基础上，通过发酵过程动力学分析以及在发酵过程中添加中间产物等方法，研究不同调控条件下合成途径主要酶表达水平的变化规律及其对多糖合成的影响。本课题的研究将揭示液体发酵过程灵芝多糖生物合成的基本途径，为进一步研究其精细代谢调控机制和多糖转运机理提供良好的理论依据；对提高灵芝多糖的发酵水平具有极大的促进作用；对其他真菌多糖的相关研究有重要的借鉴意义。

本项目首先利用图形软件分析和定量计算，研究了不同调控条件下培养过程中的灵芝菌体形态的变化及其对多糖合成的影响，结果表明菌球当量直径对多糖产量有着明显的影响，而粗糙度与多糖产量之间则无明显的相关性，当菌球当量直径控制在0.8-2.5mm时有利于多糖的合成。但无论是菌球粗糙度还是当量直径，菌球形态的变化与多糖的单糖组成及比例之间没有明显的相关性。根据项目申报中推断的灵芝多糖合成途径，在不同调控体系下，对途径中的9种相关酶和中间产物进行了分析；通过分析灵芝多糖的单糖组成及比例的变化，发现葡萄糖、半乳糖和甘露糖为灵芝多糖中常见的主要组分；根据已公布的灵芝基因组序列，利用生物信息学方法初步构建了灵芝基因组代谢模型，从比较基因组学的角度讨论了灵芝多糖的合成与代谢；结合代谢过程酶活性分析、单糖组成分析以及生物信息学分析，完善了灵芝多糖的合成途径。进一步的，通过对灵芝多糖合成途径中9种酶活性与单糖组成的相关性分析，发现磷酸葡萄糖异构酶（PGI）、磷酸葡萄糖变位酶（PGM）和磷酸甘露糖异构酶（PMI）为灵芝多糖合成中比较关键的酶。通过原生质体融合构建pgm和pgi的过表达体系，发现pgm和pgi的过表达能够促进灵芝多糖的合成；利用混合碳源，验证了PGI、PGM、PMI与甘露糖以及半乳糖之间的相关性，通过转录水平的分析推测出混合碳源对灵芝多糖中单糖组成的影响通过其翻译过程达到；并通过分别添加不同相关物质（如玉米粉、灵芝多糖合成过程中的中间产物）结合双向电泳与质谱分析以及数据库比对，从不同角度进一步验证了上述推测结果。本项目完善了液体发酵过程灵芝多糖的合成途径，明确了显著影响灵芝多糖中单糖组成比例的三个关键酶，为进一步研究其精细代谢调控机制和多糖转运机理提供了良好的理论依据；同时液体发酵过程灵芝菌球形态的研究对提高灵芝多糖的发酵水平具有极大的促进作用；对其他真菌多糖的研究具有重要的借鉴意义。