仔猪小肠甘氨酸亚铁螯合物吸收转运的分子机制研究

Previous studies have shown that, ferrous glycinate was more efficiency in improving the iron status of human and animals, and had different impacts on the relevant intestinal transporters compared with ferrous sulfate，but the concrete molecule mechanism about its high bioavailability is still unknown. On the basis of previous studies, feeding trial is designed in current project to study the bioavailability of ferrous glycinate on piglets. Intestinal perfusion model in vitro and brush border membrane vesicles model are established to study the absorption efficiency of ferrous glycinate in the intestinal. The kinetics absorption characteristics of ferrous glycinate in the piglets intestinal are determined by perfusion model in vivo. The gene chip analyses are used to reveal differential genetic response to the different iron source, to explore the iron absorption relevant intestinal transporters. The function of relevant membrane protein in the piglets intestinal epithelial cells are evaluated by using small interference RNA, protein inhibitor and fluorescent tracking, and the storage and metabolism of iron in the cells is also researched. Through these studies, the possible absorption and transport molecule mechanism of ferrous glycinate in the piglets intestinal could be clarified, which would lay foundation to the intensive study and scientific use of organic trace elements.

前期研究发现，甘氨酸亚铁具有较高的生物学利用率，能够快速改善人及动物机体缺铁状态，且对肠道特定膜吸收转运蛋白表达的影响与硫酸亚铁有所不同，然而其吸收转运机制尚不明确。本项目在前期研究基础上，以断奶仔猪为对象，拟通过饲养试验、体内灌胃、体外肠道灌注及小肠刷状缘模型，研究甘氨酸亚铁在肠道中的吸收效率及吸收动力学特点；构建基因表达谱芯片，筛选肠道铁吸收差异表达基因，进一步探寻甘氨酸亚铁吸收转运特异性蛋白；以仔猪小肠上皮细胞为模型，针对关键吸收转运蛋白，进行RNA干扰、膜蛋白抑制阻断及荧光标记膜蛋白追踪试验，研究甘氨酸亚铁跨膜吸收的可能途径及特定膜蛋白在其吸收转运中的功能，同时研究胞内可变铁池、活性氧及铁蛋白表达，探讨甘氨酸亚铁跨膜转运与代谢利用效率。通过上述研究，进一步阐明甘氨酸亚铁螯合物吸收转运的分子机制，为高生物学效价的有机微量元素在动物营养中的深入研究与科学应用提供理论依据。

铁是动物维持生命和生长必不可少的微量元素之一。前期研究发现，甘氨酸亚铁具有较高的生物学利用率，然而其吸收转运机制尚不明确。本项目通过体内外试验相结合的方法，研究甘氨酸亚铁的吸收效率及其吸收转运的分子机制。在动物机体水平上，主要以断奶仔猪和SD大鼠为对象，研究不同铁源对动物生长性能、血清及肝脏铁水平、铁代谢相关基因及蛋白表达水平的影响，同时运用转录组测序技术，针对不同铁源处理的十二指肠样本进行高通量筛选，寻找相关的差异表达基因并进行深入研究；在细胞水平上，以仔猪小肠上皮细胞（IPEC-J2）为模型，研究不同铁源对细胞增殖活性及铁吸收相关基因的影响；运用CRISPR-Cas9基因敲除技术，构建二价金属离子转运蛋白（DMT1）缺失的Caco-2细胞株，研究不同铁源对细胞内可变铁池（LIP）、铁蛋白表达和相关转运调控蛋白表达的影响。研究结果显示：日粮中补充铁源可以改善仔猪的机体铁状态，促进肠道形态结构发育，且甘氨酸亚铁的效果要优于硫酸亚铁；灌胃甘氨酸亚铁能提高SD大鼠血清铁水平、增加肠道铁蛋白沉积，改善机体的铁状态；甘氨酸亚铁和硫酸亚铁在低浓度下对细胞生长没有明显影响，而当铁浓度较高时均产生了明显的细胞毒性，且硫酸亚铁比甘氨酸亚铁对细胞的影响更大，另外在相同浓度下，硫酸亚铁比甘氨酸亚铁拥有更多的游离铁离子；硫酸亚铁和甘氨酸亚铁短路电流水平接近且具有相似的吸收动力学曲线；高通量测序结果显示，灌胃甘氨酸亚铁和硫酸亚铁的鼠的十二指肠中与铁相关的转运蛋白表达没有差异；Caco-2细胞对甘氨酸亚铁的吸收和对硫酸亚铁的吸收一样在很大程度上受到了DMT1敲除的影响。以上结果表明，甘氨酸亚铁可以改善动物的生长发育和机体铁状态，且其生物学利用率高于硫酸亚铁；甘氨酸亚铁可能与硫酸亚铁具有相同的肠道吸收方式，主要是通过DMT1以无机铁离子的形式被肠细胞吸收。