全基因组关联分析鉴定深层发酵灵芝菌株三萜高产关联多态性位点

Ganoderma lucidum is the most famous medicinal fungus with the most economic value in China. Modern pharmacological research has demonstrated that G. lucidum triterpenoids have multiple therapeutic actions. Deep submerged fermentation of G. lucidum is an important way to obtain triterpenoids and how to select high-yiled strains is one of the key technique in submerged fermentation. In this study, we select 48 G. lucidum strains with subtle population structure and different levels of triterpenoids yield from popular strains used in cultivation and industrial fermentation. A whole-genome shotgun strategy and Illumina HiSeq 2500 platform are employed. Sequence reads are aligned to the reference genome published by our group by using SOAP software v2.21. Our effort tries to uncover all the single-nucleotide polymorphisms (SNPs), 1-10 bp insertions and deletions, present-absent variation and copy number variants in G. lucidum genome. Then, we perform genome-wide association studies on G. lucidum triterpenoids yiled traits used K+Q mixed statistics models and identify susceptibility loci for the yield of triterpenes. This study provides a fundamental resource for G. lucidum genetics research and breeding, and GWAS can be used as a powerful complementary strategy to dissect complex traits in G. lucidum. High-density polymorphim markers reported here are expected to be a valuable resource for further genetic studies.

灵芝(Ganoderma lucidum)是我国最著名和最具经济价值的药用真菌，灵芝三萜是灵芝的主要有效成分之一，具有广泛的药理活性。深层发酵是获取灵芝三萜的重要途径，三萜高产菌株筛选是深层发酵的关键技术。本研究选取群体结构均衡、三萜产量差异明显的48种菌株。以本课题组已发表的灵芝基因组为参考序列，基于Illumina HiSeq2500测序平台，对48种菌株基因组进行重测序。通过全基因组遗传变异扫描分析，获得灵芝基因组的高密度单核苷酸多态性位点（SNPs）、插入缺失变异位点（Indels）、获得与丢失变异（PAVs）和基因拷贝数变异（CNVs）等多态性标记位点，利用InterProScan进行基因功能注释。运用Q+K多统计模型，对灵芝基因组中多态性标记与灵芝三萜产量性状进行关联分析，鉴定与灵芝三萜高产关联的关键多态性标记位点，用于深层发酵灵芝菌株的分子标记辅助育种研究。

灵芝是我国最著名和最具经济价值的药用真菌之一，补气安神，止咳平喘，延年益寿。灵芝三萜是灵芝的主要有效成分之一，当前已提取分离得到100余种三萜类成分，多数为高度氧化的羊毛甾烷衍生物，具有广泛的药理活性，包括保肝、抗肿瘤、抗HIV-1、免疫调节、抗氧化等，是新药开发的重要来源，深受化学家和药理学家青睐。由于灵芝子实体培养时间较长，三萜产量易受多种因素影响，深层发酵是获取灵芝三萜的重要途径。在灵芝三萜深层发酵技术中，三萜高产菌株快速筛选是三萜产量提高的限制因素。本研究收集我国常用栽培和发酵用灵芝菌株48种，包括中国灵芝、信州灵芝、鹿角灵芝、泰山灵芝、日本灵芝、韩国灵芝等。通过深层发酵技术获得灵芝菌丝，收集菌丝纱布过滤后测定灵芝菌丝体三萜成分含量，获得不同菌株灵芝菌丝体三萜产量性状信息。利用天根试剂盒提取总DNA，构建插入片段500 bp文库，基于Illumina X Ten测序平台进行高通量测序，利用Fastqc过滤低质量数据后，每个样品测序量（Clean Data）约1.6G，测序深度约37X，基因组覆盖度（Properly Mapped）均大于90%。以CGMCC5.0026全基因组序列信息为参考，利用Bwa、 Samtools、GATK等软件进行全基因组遗传变异扫描分析，获得灵芝基因组的高密度多态性位点图谱，其中单核苷酸多态性位点（SNPs）1 615 356，小片段插入缺失位点（Small Indels）241 871，结构变异4 506个，这些多态性位点大部分坐落在基因间或内含子上，共导致2 312个基因变异。将单核苷酸多态性位点定位到灵芝三萜生物合成上游的甲羟戊酸（MVA）途径基因，下游途径的细胞色素P450酶基因，以及可能参与转录调控的上下游区域，筛选获得候选灵芝三萜高产关联的分子标记4 043个，多数位于潜在的转录调控区域，推测可能是转录调控元件（转录因子等）的多态性影响灵芝三萜生物合成的种类和产量。本研究为灵芝菌株种质资源筛选提供有力的遗传工具，为深层发酵灵芝菌株的分子标记辅助育种提供了重要的标记资源。